УДК 615. 917

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КУМАРИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА УМБЕЛЛИФЕРОНА. РОЛЬ МЕТАБОЛИТОВ КУМАРИНА В РЕАЛИЗАЦИИ ЕГО ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)

М.Л. Зиновьева¹, Е.А. Сластья², кандидат хим. наук,П.Г. Жминько¹, доктор биол. наук

¹Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев
²ЧП "Фитон Крым", Ялта

SUMMARY. The biological activity of coumarin and coumarin metabolites is considered in this article. As shown coumarin metabolite umbelliferone demonstrates a broad spectrum of biological activity that can be promising for its use in pharmacological and food industry and requires detailed toxicological evaluation of umbelliferon.
Key words: coumarin, umbelliferon, metabolism, toxic effects.

Вещества природного происхождения, в том числе и производные кумарина, в последнее время вызывают повышенный интерес фармакологов, токсикологов и гигиенистов питания в связи с их широким спектром биологической активности, малой, как правило, токсичностью и отсутствием побочных эффектов. Одним из них является метаболит кумарина — 7-гидроксикумарин (умбеллиферон), интерес исследователей к которому возрастает в течение последних лет и сфера использования которого расширяется благодаря ряду свойств, присущих молекуле данного вещества.

Целью данного обзора является анализ данных литературы о биологической активности кумарина и его основного метаболита умбеллиферона в связи с перспективами использования последнего в качестве пищевого красителя.

Использование кумарина. Кумарин (1,2-бензопирон) — вещество растительного происхождения, входит в состав сырья, традиционно используемого в качестве натуральных ароматических добавок в пищевой и парфюмерной промышленности (рис. 1).

Сообщение о гепатотоксическом действии кумарина, выявленном в эксперименте на крысах и собаках, привело к тому, что в США он был запрещен для прямого использования в качестве пищевой добавки, начиная с 1954 г [1], что вызвало дискуссию о природе его токсичности и значительный интерес исследователей к изучению механизмов его действия.

Кумарин внесен в перечень действующих веществ ("active principles"), утвержденный Европейским Союзом (Annex II of European Directive (88/388/EEC)), согласно которого предельно допустимый уровень его содержания в пищевых продуктах и безалкогольных напитках составляет 2 мг/кг, в алкогольных напитках и некоторых видах специфических карамелей разрешены концентрации до 10 мг/кг, а для жевательной резинки — до 50 мг/кг. Однако в 1994 году на основании углубленного анализа проведенных токсикологических исследований, экспертами Европейского Совета были сделаны рекомендации о снижении допустимых уровней содержания кумарина природного происхождения в продуктах питания до 0,5 мг/кг, вследствие данных о его возможном канцерогенном и мутагенном действии [2].

Теоретически расчитанное суточное поступление кумарина с пищевыми продуктами колеблется от 1,235 мг до 4,085 мг в сутки, что приблизительно составляет от 0,02 мг/кг до 0,07 мг/кг [1]. Кроме того, как натуральный, так и синтетический кумарин широко используется в качестве ароматизатора в косметической продукции (дезодорантах, кремах, лосьонах, мылах, туалетных водах и пр.), что, с учетом уровня дермальной абсорбции (около 60%), может обеспечивать дополнительное суточное поступление в организм человека до 2,014 мг в сутки (0,03 мг/кг) [1, 3].

Природный кумарин содержится в значительных количествах в коричном и лавандовом маслах, в эфирном масле, получаемом из листьев кассии (табл. 1), в незначительных количествах — в ягодах (чернике, морошке), зеленом чае, цикории, сое (соевом белке), грибах (Tricholoma matsutake) и другом растительном сырье [1, 4].

В качестве основных потенциальных источников кумарина, поступающего в организм с пищевыми продуктами, могут рассматриваться специи, содержащие корицу, а также некоторые виды ароматизированных алкогольных напитков, в рецептуре которых используются кумаринсодержащее сырье растительного происхождения.

Кроме того, кумарину свойственна высокая биологическая активность, что послужило основанием для использования его в качестве лекарственного, в частности, противоопухолевого средства [5, 6]. Однако сообщения о гепатотоксических эффектах для человека, развивающихся вследствие приема кумаринсодержащих лекарственных препаратов [7, 8], часто противоречивые, вызвали значительный интерес исследователей к изучению его метаболизма и механизма токсического действия [9, 10].

Метаболизм кумарина. Экспериментальные данные с использованием различных видов лабораторных животных подтверждают тот факт, что основным органом-мишенью токсического воздействия кумарина при длительном поступлении в организм является печень [11, 12]. Их дискуссионный характер послужил тому, что в течение последних двух десятилетий был проведен ряд исследований in vitro и in vivo, а также элиминации кумарина из организма различных видов млекопитающих [13, 14, 15, 16, 17].

В результате было показано, что кумарину свойственны значительные видовые различия, что во многом обусловлено особенностями его метаболизма в организме [18, 19, 2].

Современные представления о метаболизме кумарина предполагают наличие двух основных путей трансформации данного соединения в организме млекопитающих (рис. 2).

Как видно из приведенной схемы (рис. 2), первый этап трансформации кумарина реализуется по двум направлениям: в результате 7-гидроксилирования кумарина образуется малотоксичный 7-гидроксикумарин, выводящийся из организма млекопитающих с мочой, а в процессе 3-гидроксилирования образуется 3-гидроксикумарин, промежуточным метаболитом в данном процессе является токсичный 3,4-эпоксид, подвергающийся дальнейшей трансформации с образованием о-гидроксифенилальдегида, окисляющегося до о-гидроксиэтанола и о-гидроксифенилуксусной кислоты. Рядом авторов было показано, что доминирование одного из двух направлений метаболизма кумарина в организме обусловливает межвидовые различия в проявлении гепатотоксических свойств данного соединения [9, 13].

Для организма приматов, как было показано в опытах на бабуинах, 7-гидроксилирование с образованием 7-гидроксикумарина, является превалирующим и наиболее эффективным путем детоксикации и элиминации кумарина [21, 22]. Аналогичный метаболический паттерн был продемонстрирован для сирийских хомячков [23] и линии мышей DBA/2J [24]. В эксперименте на данных видах животных кумарин проявлял значительно меньший гепатотоксический эффект в сравнении с другими видами животных. Интересно, что данные различия наблюдаются также и внутри одного вида. Так, мыши линии DBA/2J, также как и хомячки, являются одними из немногих представителей лабораторных грызунов, для которых метаболизм кумарина протекает в основном по пути 7-гидроксилирования [24], в то время, как для мышей линии CH3/HeJ, процесс 7-гидроксилирования в метаболизме не является преобладающим [25].

Исследование метаболизма кумарина с использованием тонких срезов печени подтвердило, что у человека, приматов, телят, а также отдельных видов грызунов, он протекает сходно, с преобладанием процесса 7-гидроксилирования, тогда как у наиболее широко используемого для токсикологических исследований вида лабораторных животных-крыс преобладает процесс 3-гидроксилирования. В организме человека образование 3,4-эпоксида кумарина является незначительным [26].

В ходе исследования механизма токсического действия кумарина было показано, что его 7-гидроксилирование в микросомах печени человека обеспечивается высокоспецифичным цитохромом Р 2А6, активность которого может быть индуцирована антиэпилептическими лекарствами, либо угнетена при тяжелых алкоголь-индуцированных циррозах печени [27]. Цитохром Р 2А6 представляет около 15 % Р450-белков в микросомах печени человека, оставаясь при этом одним из наименее изученных энзимов данной группы. На основании полученных данных было сделано предположение о том, что случаи развития и степень проявления токсических эффектов кумарина у человека могут быть обусловлены индивидуальными особенностями обменных процессов. Так, в опыте на добровольцах была продемонстрирована значительная индивидуальная вариабельность соотношения интенсивности двух метаболических путей [28], в результате чего продукция токсичного 3,4-эпоксида кумарина в организме усиливается.

В экспериментальных работах [11, 29] установлено, что кумарин при однократном введении в больших дозах крысам вызывает центрилобуллярный некроз гепатоцитов. Это свидетельствует о том, что метаболизм кумарина [3-^l4C] в данном случае проходил с образованием более токсичных метаболитов. Исследования in vitro показали, что химически активные [3-^l4C]-кумариновые метаболиты, образующиеся при участии цитохром P450-зависимых энзимов, способны ковалентно связывать микросомальные протеины [30]. Было сделано предположение, что токсическим метаболитом в данном случае может выступать 3,4-эпоксид.

Образующийся в процессе 3-гидроксилирования кумарина 3-гидроксикумарин деградирует с образованием метаболитов с открытием пирольного кольца. В микросомах печени крысы кумарин играет роль субстрата для изоэнзимов подгрупп цитохромов P450 1A и 2B [31]. В микросомальной системе печени человека за процесс 7-гидроксилирования кумарина ответственны ферменты подгруппы P450 2A [32], которые и обеспечивают основное направление метаболизма, проходящее с образованием 7-гидроксикумарина. Особенности метаболизма кумарина лежат также в основе межвидовых токсикокинетических различий. Так, при интраперитонеальном введении кумарина крысам в дозе 50 мг/кг, 50% от введенной дозы вещества выводилось с желчью в виде неидентифицированных соединений с разомкнутым пирольным кольцом. При внутрибрюшинном введении 7-гидроксикумарина в дозе 50 мг/кг с желчью выводилось только 0,2% вещества в неизмененном виде либо в виде глюкуроновых конъюгатов [33]. Было сделано предположение, что характерное для гепатотоксического эффекта кумарина повреждение желчевыводящих протоков, наблюдаемое в экспериментах на крысах, может быть обусловлено биллиарной экскрецией токсического метаболита 3,4 эпоксида. Вместе с тем, такое проявление гепатотоксичности не наблюдается у видов лабораторных животных, для которых показано преобладание метаболической трансформации кумарина с образованием 7-гидроксикумарина, которому не свойственна экскреция с желчью. Из организма человека (при пероральном введении в дозе 200 мг/кг) кумарин выводится достаточно быстро, при этом 79% выводится в виде 7-гидроксикумарина [2]. При введении в эквивалентной дозе крысам элиминация составляет только 35%, из которых 7-гидроксикумарин составляет менее чем 0,1% [34, 35]. Данные различия обусловлены быстрой абсорбцией кумарина в кишечнике человека и отсутствием энтерогепатической циркуляции основного метаболита — 7-гидроксикумарина.

Физико-химические свойства и биологическая активность 7-гидроксикумарина. 7 гидроксикумарин обнаруживается в природе в большом количестве растений — в основном семейства зонтичных Umbelliferae (откуда и получил свое название — умбеллиферон), а также рутовых и сложноцветных [36]. В растительном организме умбеллиферон является ключевым продуктом биосинтеза различных типов природных кумаринов (фурокумаринов, дигидропиранокумаринов и др.).

Очищенный умбеллиферон представляет собой желтоватые кристаллы, слабо растворим в воде и хорошо растворяется в этаноле. Характерной особенностью молекулы умбеллиферона является его способность к флуоресценции в щелочных растворах, интенсивно поглощая свет в ультрафиолетовом диапазоне с максимальной эмиссией при длинне волны 371 нм [37], что обусловливает ярко-голубое свечение раствора. Структурная формула умбеллиферона (рис. 3) свидетельствует о том, что в определенной степени он обладает химическими свойствами, присущими фенолам и кумарину.

Благодаря своей флуоресцентной активности умбеллиферон используется как компонент некоторых жидкостных светофильтров, индикатор флуоресценции в ряде флуориметрических методов исследования, кислотно-основной индикатор при рН 6,5–8,0. Умбеллиферон также входит в состав косметических продуктов в качестве ультрафиолетового фильтра. В настоящее время рассматривается возможность применения умбеллиферона в качестве пищевого красителя для напитков, придающего им своеобразный декоративный эффект в виде ярко голубого свечения в ультрафиолетовых лучах.

Увеличение количества научных публикаций в последнее десятилетие, в которых выявляются новые и продолжаются исследоваться уже известные аспекты биологической активности умбеллиферона, свидетельствуют о возрастающем интересе ученых к данному соединению. При этом в доступных литературных источниках не обнаружено данных об исследовании токсических свойств умбеллиферона, а исследование его биологической активности во многих случаях рассматривается в контексте исследований свойств кумарина, в частности токсичности и фармакологической активности последнего.

Так, в 90-е годы было сделано предположение, что именно умбеллиферон, будучи основным метаболитом кумарина, обусловливает противоопухолевую активность последнего [38]. В исследованиях in vitro было показано, что умбеллиферон оказывает цитостатическое действие на культуры опухолевых клеток: A549, ACHN, Caki-2, Dakiki, HS-Sultan, H727, HCT-15, HL-60, K562, LNCaP, PC-3, Du 145 COLO-232, MCF-7 и RP-1788. Ингибирующий эффект был зависим от дозы и времени воздействия. В исследованых культурах клеток 7-гидроксикумарин, также как и кумарин, ингибировал инкорпорацию [³H]тимидина, [³H]уридина и [³H]лейцина, внутриклеточное образование простата-специфического антигена клетками LNCaP, стимулировал апоптоз в культуре HL-60 (данный эффект однако не был показан в других испытанных культурах).

Таким образом в опытах in vitro установлено, что 7-гидроксикумарин, также как и кумарин, обладает не только прямым антиопухолевым (цитостатическим) действием, но и проявляет иммуномодулирующие свойства.

В эксперименте на мышах при внутрижелудочном введении также было продемонстрировано, что умбеллиферон, как и кумарин, ингибирует рост Sarcoma 180 и увеличивает продолжительность жизни животных [39]. Противоопухолевый эффект был более выраженным в условиях предварительного введения кумарина и умбеллиферона, что подтверждает тот факт, что наряду с цитостатическим эффектом, оба вещества обладают и иммуномодулирующими свойствами. Кроме того, был выявлен аддитивный эффект ингибирования опухолей кумарином и умбеллифероном в комбинации с субоптимальной дозой липополисахаридов. Доказано, что обоим исследованным кумаринам свойственно усиление миграционной активности макрофагов как в присутствии, так и в отсутствии липополисахаридов и увеличение продукции ими оксида азота.

В опытах in vitro умбеллиферон, как и кумарин, индуцировал образование интерлейкина-12 в мышечных макрофагах и дополнительно усиливал выработку интерлейкина-12, индуцированную липополисахаридами. Эти данные указывают на то, что прямой цитостатический эффект как кумарина, так и умбеллиферона, усиливается их иммуномодулирующей активностью, что делает их перспективными иммуностимуляторами при использовании с другими противоопухолевыми препаратами [40].

Как было сказано выше, молекулярная структура умбеллиферона свидетельствует об антиоксидантном потенциале данного вещества [41], а противоопухолевая активность его во многом связана с антиоксидантными свойствами, о чем свидетельствуют данные литературы [42]. Так, в эксперименте с использованием синтетических аналогов умбеллиферона в условиях воздействия бенз-a-пирена и пероксида водорода было продемонстрировано антиканцерогенное/aнтимутагенное действие умбеллиферона, обусловленное его способностью инактивировать свободные радикалы [43].

Позднее в исследованиях, проведенных in vitro на изолированных лимфоцитах человека [44], было показано, что умбеллиферон в диапазоне концентраций 10–400 мкM оказывал дозозависимое защитное действие на лимфоцитарную ДНК от повреждающего эффекта, индуцированного пероксидом водорода в концентрации 25 мкM. В концентрациях, превышающих 50 мкM, данный эффект умбеллиферона был сравним с действием стандартного антиоксиданта — аскорбиновой кислоты. Однако степень реализации антиоксидантного действия умбеллиферона при использовании различных моделей во многом обусловлена структурными особенностями молекулы. Так, при исследовании защитного эффекта ряда кумаринов против цитотоксического действия индуцированного гидропероксидом линоленовой кислоты в культуре клеток венозного эндотелия человека кумарины, в том числе и умбеллиферон, содержащие только одну гидроксильную группу, не оказывали защитного действия на клетки культуры ни в случае предварительного воздействия, ни в условиях конкурентного влияния. Это подтверждают сравнительные исследования взаимодействия умбеллиферона и 4-гидроксикумарина с использованием модельных биламеллярных липидных мембран [45], показавшие, что для молекулы умбеллиферона вследствие ее амфифильной структуры (в сравнении с 4-гидроксикумарином, полярность молекулы которого более выражена), инкорпорация в липидную мембранную структуру затруднена.

Противовоспалительный и иммуномодулирующий эффект умбеллиферона исследован на модели бронхиальной астмы у мышей линии BALB/c, иммунизированных яичным альбумином [46]. В дозах 60 мг/кг и 90 мг/кг умбеллиферон вызывал значительное снижение клеточности и количества эозинофилов в бронхиальных смывах мышей с астматической патологией. Кроме того, терапевтический эффект проявлялся в уменьшении образования слизи и воспалительных явлений в легких, что было подтверждено результатами гистопатологического исследования. Также отмечено снижение содержания интерлейкинов IL-4, IL-5 и IL-13 в бронхиальном секрете мышей при действии умбеллиферона. Данные изменения были аналогичны тем, которые наблюдались в случае использования контрольного противовоспалительного препарата — дексаметазона.

Таким образом, в опытах на животных установлено, что умбеллиферон корректирует аллергические и иммунные изменения дыхательных путей, вызванные астматическим процессом.

Попытки раскрыть механизм противовоспалительного действия умбеллиферона сделаны при изучении его воздействия на секреторную фосфолипазу A2 из яда гремучей змеи в опыте in vitro [47]. Было показано, что умбеллиферон оказывает необратимое ингибирование энзиматической активности, пропорциональное его концентрации, а более детальное исследование биофизического взаимодействия умбеллиферона и фермента показало, что 7-гидроксикумарин вызывает значительные конформационные изменения молекулы секреторной фосфолипазы A2. Полученные данные были подтверждены авторами в опыте in vivo на модели воспаления лапы мыши, индуцированного секреторной фосфолипазой A2. При этом наблюдалось уменьшение отека кожи и мышцы, а также снижение дегрануляции тучных клеток. Противовоспалительная активность умбеллиферона была сравнима с эффектом дексаметазона и ципрогептадина.

Однако сравнительный анализ противовоспалительного действия в условиях внутрижелудочного введения крысам умбеллиферона в диапазоне доз 0,01–20,0 мг/кг и кумарина в дозах 2,5–60 мг/кг на модели карагинанового воспаления [48] показал, в данном случае, отсутствие терапевтического эффекта умбеллиферона во всем исследованном диапазоне доз в отличие от кумарина.

Ряд исследований посвящен влиянию умбеллиферона на различные ферментативные системы. Так, сравнительное исследование влияния умбеллиферона и ряда других соединений кумаринового ряда на активность липазы in vitro [49] показало, что умбеллиферон проявлял противоположное действие в сравнении с кумарином и ускорял липолиз, в то время как кумарин обладал способностью угнетать активность липазы.

Особенное внимание обращают на себя систематические публикации индийских исследователей последних лет, посвященные комплексному исследованию применения умбеллиферона для воздействия на различные звенья диабетической патологии в эксперименте на крысах в условиях стрептозотоцин-индуцированной модели. В результате была продемонстрирована высокая эффективность умбеллиферона, сравнимая с традиционными лекарственными средствами. Как было показано, 7-гидроксикумарин оказывал защитное действие на комплекс жирных кислот клеточных мембран печени и почек, обусловленное его антиоксидантной и антигиперлипидемической активностью [50], нормализовал в сыворотке крови животных активность ферментов-маркеров повреждения гепатоцитов, что может свидетельствовать как о его защитном воздействии на гепатоциты, так и о нормализующем воздействии на секрецию инсулина [51]. Умбеллиферон предотвращал снижение массы печени, вызванное диабетической патологией, нормализовал содержание в ней гликогена, а также концентрацию белка в сыворотке крови, что, вероятно, обусловлено стимуляцией синтеза инсулина [52], восстанавливал активность мембрано-связанных АТФ-аз в эритроцитах и нормализовал обмен глюкозы [53]. Умбеллиферон оказывал антигиперлипидемическое действие [54], предупреждал гликозилирование белков и образование свободных радикалов при окислении глюкозы и препятствовал процессам липопероксидации путем инактивации свободных радикалов и усиления активности как ферментативных, так и неферментативных антиоксидантных систем [55]. Было показано, что при воздействии умбеллиферона происходит нормализация биохимических показателей хрящевой ткани и показателей свертываемости крови у животных со стрептозотоцин-индуцированным диабетом [56].

Особого внимания заслуживает тот факт, что умбеллиферон в данном случае оказывает нормализующее воздействие, не влияя по данным авторов исследования на показатели интактных животных, что в перспективе может быть использовано для разработки пищевой добавки с профилактическими свойствами.

Выводы. Значительную роль в реализации гепатотоксического эффекта кумарина у человека и приматов принадлежит его метаболиту 3,4-эпоксикумарину. Умбеллиферон яляется одним из основных, малотоксичных, метаболитов кумарина. Проявление межвидовой и внутривидовой чувствительности к воздействию кумарина зависит от направленности его метаболизма.

Умбеллиферон обладает широким спектром биохимических и фармакологических эффектов, отчасти обусловленных антиоксидантной активностью молекулы, отчасти — воздействием на более тонкие обменные процессы на клеточном и молекулярном уровнях. Это — перспективное вещество для разработки средств коррекции ряда патологических состояний.

Высокая биологическая активность умбеллиферона, а также способность его к флуоресценции в растворах свидетельствует о необходимости проведения дальнейших углубленных токсикологических исследований данного соединения.

Литература
1. Lake B.G. Coumarin metabolism toxicity and carcinogenicity: relevance for human risk assessment / B.G. Lake // Food and Chemical Toxicology. —1999. —№37. —Р. 423–453.
2. Carlton B.D. Effects of Coumarin Following Perinatal and Chronic Exposure in Sprague-Dawley Rats and CD-1 Mice / B.D. Carlton, J.-C. Auburn, G.S. Simon // Fundamental and Applied Toxicology. —1996. —№30. —P. 145–151.
3. Opdyke D.L.J. Monographs on fragrance raw materials: coumarin / D.L.J. Opdyke// Food and cosmetics Toxicology . —1974. —№12. —P. 385—388.
4. Качественное обнаружение кумаринов в растительном сырье / Г.А. Дрозд, Н.Ф. Комиссаренко // IV Всесоюзный симпоз. по фенольным соединениям. —Ташкент. —1982. —С. 27–28.
5. The pharmacology, metabolism, analysis and applications of coumarin and coumarin-related compounds / D.Egan, R. O'Kennedy, E. Moran [et al.] // Drug. Metab. Rev. 1990. —№22. —P. 503–529.
6. Phase II study of coumarin and cimetidine in patients with metastatic renal cell сarcinoma / F.H. Dexeus, С.J. Logothetis, F.A. Sella,. [et al.] // J. Clin. Oncol. 1990. —№8. —P. 325–329.
7. Cox, D. The relevancy of liver toxicity in patients treated with coumarin (1,2-benzo-pyron) / D. Cox, R. O'Kennedy, R.D. Thornes // Hum. Toxicol..—1989. —№8. —P. 501–506.
8. Morris L. Side-effects of coumarin / L. Morris, P.D. Welsby // Postgrad. Med. J. —1995. —№71. —P. 701–702.
9. Toxicity of coumarin / L.W. Hazleton, T.W. Tusing, M.K. Zeitlin [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. —1956. —№118. —P. 348–358.
10. Cohen A.J. Critical review of the toxicology of coumarin with special references to interspecies differences in metabolism and hepatotoxic response and their significance to man / A.J. Cohen // Food Chem. Toxicol. —1979. —№17. —P. 277–289.
11. Lake B.G. Investigations into the mechanism of coumarin-induced hepatotoxicity in the rat / B.G. Lake // Arch. Toxicol. Suppl. —1984. —№7. —P. 16–29.
12. Lake B.G. Effect of pretreatment with some mixed-function oxidase enzyme inducers on the acute hepatotoxicity of coumarin in the rat / B.G. Lake, J.G. Evans // Food Chem. Toxicol. —1993. —№31. —P. 963–970.
13. Comparative metabolism and kinetics of coumarin in mice and rats / S.L. Born, A.M. Api, R.A. Ford [et al.] // Food Chem. Toxicol. —2003. —№41. —P. 247–258.
14. Beckley-Kartey S.A.J. Comparative in vitro skin absorption and metabolism of coumarin (1,2-benzopyrone) in human, rat and mouse / S.A.J. Beckley-Kartey, S.A.M. Hotchkins, M. Capel // Toxicology and Applied Pharmacology . —1997. —№145. —P. 34–42.
15. Metabolism and toxicity of coumarin on cultured human, rat, mouse and rabbit hepatocytes / D. Ratanasavanh, D. Lamiable, M. Biour [et al.] // Fundam. Clin. Pharmacol. —1996. —V.10(6). —P. 504–510.
16. Born S.L. O-hydroxyphenylacetaldehyde (o-HPA) is a hepatotoxic metabolite of coumarin / S.L. Born, J.K. Hu, L.D. Lehman-McKeeman // Toxicological Sciences. —1998. —V.42. —№1–S. —P. 400–403.
17. Mechanism-based inactivation of human liver cytochrome P450 2A6 by 8-methoxypsoralen / L.L. Koenigs, R.M. Peter, S.J. Thompson [et al.] // Drug Metabolism and Disposition. —1997. —№25. —P. 1407–1415.
18. Fentem J.H. Species differences in the metabolism and hepatotoxicity of coumarin / J.H. Fentem, J.R. Fry // Comp. Biochem. Physiol. —1993. —№104. —P. 1–8.
19. Fentem J.H. Species differences in the hepatotoxicity of coumarin: A comparison of rat and Mongolian gerbil / J.H. Fentem, J.R. Fry, N.W. Thomas // Toxicology. —1992. —№71. —P. 129–136.
20. Liquid chromatographic determination оf the glutathione conjugate and ring opened metabolites formed from coumarin epoxidation. / J. D. Vassallo, S. W. Morall, Fliter, [et al.] // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. —2003. —№794. —P. 257–271.
21. Gangolli S.D. Studies on the metabolism and hepatotoxicity of coumarin in the baboon / S.D. Gangolli, W.H  Shilling, P. Grasso , L.F. Gaunt // Biochem. Soc Trans. —1974. —№2. —P. 310–312.
22. Evans, J.G. Two-year toxicity study on coumarin in the baboon / J.G. Evans, I.F. Gaunt, B.G. Lake // Food Cosmet. Toxicol. —1979. —№17. —P. 187–193.
23. Ueno I. Non-carcinogenic response to coumarin in Syrian golden hamsters / I. Ueno, I. Hirono // Food Cosmet. Toxicol. —1980. —№19. —P. 353–355.
24. Wood A.W. Genetic variation in coumarin hydroxylase activity in the mouse (mus musculus) / A. W. Wood, A.H. Conney // Science. —1974. —№185(4151). —P. 612–614.
25. Endell W. Coumarin toxicity in different strains of mice. / W. Endell, G. Seidel // Agents Actions. —1978. —№8. —P. 299–302.
26. Metabolism of coumarin and 7-ethoxycoumarin by rat, mouse, guinea pig, Cynomolgus monkey and human precision-cut liver slices / A. Steensma, J.A. Beamand, D.G. Walters [et al.] // Xenobiotica . —1994. —№ 24. —P. 893–907.
27. Pelkonen O. CYP2A6: a human coumarin 7-hydroxylase / O. Pelkonen, A. Rautio, H. Raunio, M. Pasanen // Toxicology . —2000. —V.144. —Issues 1–3. —P. 139–147.
28. A single amino acid substitution (Leu160His) in cytochrome P450 CYP2A6 causes switching from 7-hydroxylation to 3-hydroxylation of coumarin / H. Hadidi, K. Zahlsen, J.R. Idle [et al.] // Food and Chemical Toxicology . —1997. —№35. —P. 903–907.
29. Studies on the mechanism of coumarin-indiced toxicity in rat hepatocytes: Comparison with dihydrocoumarin and other coumarin metabolites / B.G. T. J. Lake, J.G. Gray, Evans [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. —1989. —№97. —P. 311–323.
30. Studies on the induction of cholangiofibrosis by coumarine on the rat / J.G. Evans, E.C. Appleby, B.G. Lake [et al.] // Toxicology. —1989. —№55. — P. 207–224.
31. Effect of inducers of cytochrome P450 on the metabolism of [3-HC] coumarin by rat hepatic microsomes / M.M. Peters, D.G. Walters, B. van Ommen, [et al.] // Xenobiotica. —1991. —№21. —P. 499–514.
32. Identification of the human liver cytochrome P-450 responsible for coumarin 7-hydroxylase activity/ J.S. Miles, A.W. McLaren , L.M. Forrester [et al.] // Biochem. J. —1990. —№ 267. —P. 365–371.
33. Williams R.T. The influence of enterohepatic circulation on toxicity of drugs / R.T. Williams, P. Millburn, R.L. Smith // Ann. N. Y. Acad. Sci. —1965. —123. —P. 110–113.
34. Shilling, W.H. Metabolism of coumarin in man / W.H. Shilling, R.F. Crampton, R.C. Longland // Nature. —1969. —№ 221. —P. 664–665.
35. Feuer G. Liver response tests. VII Coumarin metabolism in relation to the inhibition of rat-liver glucose 6-phosphatase /G. Feuer, L. Golberg, K. Gibson // Food. Cosmet. Toxicol. —1966. —№ 4. —P. 157–167.
36. Berenbaum M. Coumarins and caterpillars: a case for coevolution. / M. Berenbaum // Evolution. —1983. —№37(1). —P. 163–179.
37. Guilbault G.G Practical fluorescence / edited by George G. Guilbault . —New York. USA. —1990. —249 p.
38. Marshall M.E. Growth-inhibitory effects of coumarin (1,2-benzopyrone) and 7-hydroxycoumarin on human malignant cell lines in vitro / M.E. Marshall, K. Kervin, C. Benefield // J. Cancer Res. Clin. Oncol . —1994, V. 120. —suppl.1. —P. 3–10.
39. Seliger B. 7-Hydroxycoumarin inhibits oncogene-induced transformation of murine fibroblasts / B. Seliger, H. Pettersson // J. Cancer Res. Clin. Oncol . —1994. —№ 20 (Suppl). —P. 23–27.
40. Antitumor and immunomodulatory affect of coumarin and 7-hydroxycoumarin against Sarcoma 180 in mice / T.N. Stefanova, N.J. Nikolova, R.A. Toshkova [et al.] // Journal of experimental therapeutics & oncology. —2007. —№6(2). —P. 107–115.
41. Hoult J. Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins:natural products with therapeutic potential / J. Hoult, M. Paya // Gen. Pharmacol. —1996. —№7. —P. 713–722.
42. Kostova I. Synthetic and natural coumarins as cytotoxic agents / I. Kostova // Curr. Med. Chem. —Anti-Cancer Agents. —2005. —V.5. —№. 1. —P. 29–46.
43. Umbelliferone analogs and their potential to inhibit benzo(a)pyrene- and hydrogen peroxide-induced mutations / S.P. Pillai, S.R. Menon, L.A. Mitscher [et al.] // J. Nat. Prod. —1999. —V.62. —P. 1358–1362.
44. Evaluation of antigenotoxicity effects of umbelliprenin on human peripheral lymphocytes exposed to oxidative stress / F. Soltani, F. Mosaffa, M. Iranshahi [et al.] // Cell. Biol. Toxicol. —2009. —№ 25(3). —P. 291–296.
45. Wojkowich K. Ultrasound investigation of the effect of 4-hydroxycoumarin and umbelliferon on lipid bilayers / K. Wojkowich // Molecular and Quantum Acoustics . —2007. —V.28. —P. 285–292.
46. Effects of umbelliferone in a murine model of allergic airway inflammation / J.F. Vasconcelos, M.M. Teixeira, J.M. Barbosa-Filho [et al.] // European Journal of Pharmacology. —2009. —V.609. —Issues 1–3. —P. 126–131.
47. Effect of umbelliferone (7-hydroxycoumarin, 7-HOC) on the enzymatic, edematogenic and necrotic activities of secretory phospholipase A2 (sPLA2) isolated from Crotalus durissus collilineatus venom / D.O. Toyamaa, S. Marangonib, E.B.S. Diz-Filhob [et al.] // Toxicon. —2009. —V. 53. —Issue 4. —P. 417–426.
48. Hardt T.J. Investigation of the dose response relationship upon intraperitoneal administration of coumarin and 7-hydroxycoumarin on the carrageenan induced edema of the rats hind paw / T.J. Hardt , W.A. Ritschell // Arzneim. Forsch. —1983. —V.33. —issue 12. —P. 1662–1666.
49. Янченко П.С. Виділення та вивчення деяких кумаринів і хромонів із рослин родин бобові та селерові та їх ліпазотропна активність / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, Г.В. Георгієвський, А.М. Комісаренко // ФАРМАКОМ. —2004. —№2. —C. 1–7.
50. Ramesh B. Protective effect of umbelliferone on membranous fatty acid composition in streptozotocin-induced diabetic rats / B. Ramesh, P. Viswanathan P., K.V. Pugalendi // European Journal of Pharmacology. —2007. —V.566. —Issues 1–3. —P. 231–239.
51. Ramesh B. Impact of umbelliferone (7-hydroxycoumarin) on hepatic marker enzymes in streptozotocin diabetic rats / B. Ramesh , K.V. Pugalendi // Indian J. Pharmacol. —2006. —№ 38. —P. 209–210.
52. Ramesh B. Antihyperglycemic effect of umbelliferone in STZ-diabetic rats. / B. Ramesh, K.V. Pugalendi // J. Med. Food . —2006. —№9 (4). —P. 562–566.
53. Ramesh B. Influence of umbelliferone on membrane-bound ATPases in streptozotocin-induced diabetic rats / B. Ramesh, K.V. Pugalendi // Pharmacol. Rep. —2004. —№ 59(3). —P. 339–348.
54. Ramesh B. Antihyperlipidemic and antidiabetic effects of umbelliferone in streptozotocin diabetic rats / B. Ramesh, K.V. Pugalendi // Yale J. Biol. Med. —2005. —№78(4). —P. 189–196.
55. Ramesh B. Impact of umbelliferone on erythrocyte redox status in STZ-diabetic rats / B. Ramesh, K.V. Pugalendi // Yale Journal of Biology and Medicine. —2005. —№78. —P. 11–18.
56. Ramesh B. Effect of umbelliferone on tail tendon collagen and haemostatic function in streptozotocin-diabetic rats / B. Ramesh, K.V. Pugalendi // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. —2007. —V. 101. —№ 2. —P. 73–77.