УДК 547.231:543.064

К ВОПРОСУ ОБ ОПРЕДЕЛЕНИИ N-НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

О.С. Зульфигаров, кандидат хим. наук, В.В.Юрченко, кандидат хим. наук, Н.В. Каширина, Н.А. Стадничук

Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев, Украина

SUMMARY. The article discusses the analysis of foods for N-nitrosamines and the data on N-nitrosamines content of various food products. As a way of increasing efficiency and objectivity of nitrosamines monitoring, it is offered to control the content of their precursors — amines, nitrosating agents, catalysts and inhibitors.

В настоящее время большое внимание уделяется контролю продуктов питания на содержание супертоксикантов: пестицидов, ПАУ, хлорированных бифенилов, диоксинов и др. [1]. В этом ряду особое место занимают N-нитрозамины (НА) — вещества, легко образующиеся из широко распространенных в окружающей среде соединений.

Известно множество химических реакций, по которым могут быть синтезированы НА [2]. Однако основной причиной их образования в различных объектах, в том числе и в пищевых продуктах, является взаимодействие вторичных аминов с нитрозирующими агентами:

Нитрозирующими агентами обычно служат производные азотистой кислоты: NO⁺; ClNO; N₂O₃. При определенных условиях первичные, третичные и даже четвертичные амины также могут образовывать НА [2].

НА представляют собой маслянистые жидкости или твердые вещества, умеренно растворимые в воде и хорошо растворимые во многих органических растворителях, они обладают достаточно высокой стабильностью, превышающей устойчивость нитродиалкиламинов. НА не расщепляются растворами щелочей и разбавленных кислот и почти не подвергаются разрушающему действию рассеянного света. Эти свойства НА предопределяют их длительное присутствие в продуктах питания. Они отличаются высокой летучестью и перегоняются с водяным паром без разложения.

НА обладают широким спектром токсического действия на организм человека [1—3]. В первую очередь, токсичность НА направлена на печень и почки, в результате чего происходит нарушение их функции и некрозы. Наиболее токсичным в этом отношении является нитрозодиметиламин (НДМА), для которого ЛД₅₀ при однократном введении крысам составляет около 30 мг/кг массы тела. Однако наибольшую опасность для организма человека представляют высокие мутагенные свойства, а также широкий спектр канцерогенного действия НА, которые могут вызывать образование опухолей желудка, пищевода, легких, мочевого пузыря, трахеи, гортани, носовой полости. Минимальная канцерогенная доза НДМА для крыс составляет около 0,1 мг/кг массы тела в день. Относительно небольшие, часто нетоксичные дозы НА могут вызывать образование опухолей различных органов, причем большинство НА оказывают канцерогенное действие при однократном введении. Наибольшей канцерогенной активностью обладает нитрозодиэтиламин (НДЭА).

Установлено, что канцерогенное действие оказывают не сами НА, а продукты их метаболизма, образующиеся под воздействием ферментов. Действие нитрозаминов на организм обусловлено реакцией алкилирования ДНК продуктами их метаболизма, что ведет к нарушению функционирования генома клетки. Считается, что для возникновения опухолей и мутагенного эффекта существенным является алкилирование гуанина ДНК, что ведет к нарушению передачи генетической информации.

Важное значение в генезе рака имеет образование НА из предшественников непосредственно в организме, поэтому необходимо учитывать возможность попадания в продукты питания не только самих НА, но и их не канцерогенных предшественников — аминов и нитрозирующих агентов.

В связи с вышеизложенным, для решения проблемы канцерогенной безопасности пищи необходимо усовершенствовать пищевые технологии, предупреждающие образование канцерогенных НА в продуктах питания, а также обеспечить их надежный контроль.

В Украине содержание НА в пищевых продуктах регулируют "Державні санітарні правила і норми захисту продовольчої сировини та продуктів харчування від забруднення нітрозамінами" [4]. Согласно этому документу НА в пищевых продуктах не должны превышать допустимых уровней:
0,015 мг/кг — для пивоваренного солода и продовольственного зерна;
0,002 мг/кг — для мяса, колбасных изделий, консервов мясных;
0,003 мг/кг — для рыбы и изделий из рыбы, пива.

Определение НА в пищевых продуктах при таких низких содержаниях является сложной и трудоемкой аналитической задачей. Исходя из чрезвычайно низких значений ПДК, основными требованиями, предъявляемыми к методам определения НА в этих объектах, являются высокая чувствительность и селективность.

Первым этапом определения НА является их выделение из анализируемых продуктов. Невысокие температуры кипения (меньше 200°С) и достаточная термическая стабильность нитрозаминов обусловили возможность применения для выделения НА отгонки с водяным паром. Простота в исполнении, универсальность по отношению к самым разным пищевым продуктам, полнота извлечения обусловили наиболее широкое применение этого подхода [5]. Затем из водных отгонов НА выделяют методом экстракции, наилучшим экстрагентом для этого оказался хлористый метилен, который и находит наибольшее применение [6—9]. Данная схема выделения эффективна как для жидких проб, так и для твердых, она используется и в нашей лаборатории [10]. В то же время описаны методики непосредственной экстракции НА органическим растворителем из твердой пробы [5, 11]. Необходимо отметить важность контроля чистоты применяемого для экстракции хлористого метилена. Результаты наших исследований и данные литературы указывают, что иногда применяемый хлористый метилен может содержать НДМА и НДЭА [3], либо содержать другие примеси, которые обуславливают ложноположительные результаты [12].

Наиболее распространенный в газовой хроматорафии пламенно-ионизационный детектор из-за ограниченной чувствительности и селективности практически не применяется для прямого газохроматографического определения НА [2, 5], электронно-захватный детектор также неэффективен для этой цели. В 1975 году специально для контроля НА в пищевых продуктах был создан хемилюминесцентный термоэнергетический анализатор [13]. Действие его основано на каталитическом пиролизе НА при температуре выше 450°С. Образующийся при этом радикал NO^. взаимодействует с озоном, в результате реакции образуется возбужденная молекула NO₂^., которая, переходя в основное состояние, испускает характерное излучение в ИК-области спектра [2]. Этот детектор может быть использован в сочетании не только с газовыми, но и жидкостными хроматографами, а также для непосредственного анализа проб. Газохроматографический метод с применением данного детектора для анализа дихлорметановых экстрактов из водных дистиллятов проб пищевых продуктов утвержден в России в качестве арбитражного [7]. Метод характеризуется высокой чувствительностью, нижний предел определения составляет 10^-7 моль/л НА в экстракте и 0,1 мкг/кг в пробе. Однако, несмотря на отмеченную выше высокую селективность метода, не только N-нитрозамины, но и соединения, содержащие С- и О-нитрозо- и нитро-группы, а также соединения, содержащие кратные связи, дают на хроматограммах дополнительные пики, которые могут препятствовать детектированию НА и быть причиной ложноположительных результатов [5, 13].

Не уступает по чувствительности термоэнергетическому анализатору фотокондуктометрический детектор [9], применяемый для прямого определения НА методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако при его использовании имеет место та же проблема, связанная с детектированием примесей, содержащихся в концентрате и компонентах элюента. Кроме того, как показали наши исследования, весьма непросто обеспечить необходимое удерживание гидрофильного НДМА.

Проблема слабого хроматографического удерживания исходных НА успешно решается с использованием дериватизирующих реагентов. Этот подход позволяет также существенно расширить набор детекторов, на которых можно проводить контроль НА в продуктах питания. При использовании гептанфторбутирилхлорида или гептафтормасляного ангидрида в пиридине НА в одну стадию превращают в соответствующие галогенсодержащие амиды, которые можно эффективно определить методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим или электронно-захватным детектором [3]. Однако наибольшее распространение в аналитической химии НА нашел подход, заключающийся в их предварительном денитрозировании, с последующим определением образовавшихся вторичных аминов с применением богатого арсенала дериватизирующих реагентов, известных для определения аминов. Первым отметим использование дансилхлорида. Дансилпроизводные аминов удобны для масс-спектрометрического определения. В масс-спектрах дансиламидов, полученных из различных НА, имеется интенсивный осколочный ион, общий для всех производных с m/z 171, а также молекулярные ионы, присущие отдельным НА [14]. Эффективное детектирование дансилпроизводных НА можно провести и флуоресцентным методом [9, 16].

Вместо дансилхлорида для хромато-масс-спектрометрического определения НА можно использовать 7-хлор-4-нитробенз-2-окси-1,3-диазол (НБД) [16]. В масс-спектрах НБД-производных НА имеются интенсивные молекулярные и характеристические осколочные ионы. Возможности этого метода аналогичны методу с применением дансилхлорида, но НБД имеет определённые преимущества перед дансилхлоридом, поскольку НБД-дериваты не только флуоресцируют, но и интенсивно окрашены в желтый, оранжевый или розовый цвета, а сам реагент не флуоресцирует и не образует флуоресцирующих производных с фенолами и спиртами.

Госкомсанэпиднадзором России в 1993 г. была утверждена методика определения НА в пищевых продуктах в виде их производных с N-(8-метокси-5-хинолинсульфонил)азиридином методом тонкослойной хроматографии с флуориметрическим детектированием [7]. Методика отличается продолжительностью синтеза производных и многостадийностью их хроматографического разделения, однако при этом обеспечивается лишь полуколичественное определение НА, нижний предел определения составляет 1 мкг/кг продукта.

В нашей лаборатории показана эффективность определения НА после дериватизации соответствующих вторичных аминов 4-нитрофенилдиазонием [10].

Полученные производные достаточно гидрофобны и легко могут быть сконцентрированы, а затем разделены методом обращеннофазной ВЭЖХ. Поскольку нитрофенилтриазены хорошо окрашены, чувствительность их детектирования на обычных, наиболее распространенных фотометрических детекторах, достаточно высока и составляет 2•10^-7 моль/л. Это позволяет определять НА в пищевых продуктах при их содержании на порядок ниже ПДК. Важным обстоятельством является возможность применения данной методики для определения соответствующих вторичных аминов [18]. Наконец, применяемый дериватизирующий реагент — нитрофенилдиазоний — существенно доступнее и дешевле [19] всех описанных выше реагентов. На рисунке представлены хроматограмма и спектры поглощения азопроизводных диалкиламинов.

Поскольку при использовании не масс-селективных детекторов, проблема селективности детектирования становится первостепенной, особое внимание необходимо уделять достоверности положительных результатов. В таких случаях обязательным является анализ холостой пробы, который подтвердит чистоту применяемых реагентов, растворителей и посуды, кроме того, весьма предпочтительным является использование диодноматричного детектора, что позволит оценить спектральную чистоту зарегистрированного пика компонента пробы и сопоставить его спектр поглощения со спектром деривата стандартного вещества.

Многолетний опыт нашей лаборатории по контролю загрязнения продуктов питания нитрозаминами показывает, что случаи их присутствия в концентрациях, превышающих ПДК, единичны. Эти данные совпадают с результатами работы бразильских и американских исследователей, которые проанализировали 166 марок пива из 21 страны, и лишь в половине проб ими были зарегистрированы НА (НДМА), причем в концентрации меньше 0,55 мкг/кг при среднем содержании 0,07 мкг/кг [20]. С другой стороны, в тех образцах, где нами были зарегистрированы НА, одновременно присутствовали соответствующие вторичные амины, причем на 2—3 порядка в более высоких концентрациях.

Анализ многочисленных литературных данных, а также результаты наших исследований позволяют сделать несколько выводов относительно оптимизации контроля канцерогенных НА в продуктах питания:
1. Необходим дополнительный анализ возможных путей попадания НА в различные виды пищевых продуктов.
2. Это позволит более дифференцированно подойти к нормированию НА в различных продуктах и конкретизировать перечень продуктов, подлежащих обязательному контролю.
3. Необходимо также рассмотреть контроль предшественников НА — вторичных алифатических и ароматических аминов, а также нитрозирующих агентов, катализаторов и ингибиторов нитрозирования. Возможно, для некоторых типов продуктов достаточно проводить лишь контроль предшественников НА, например, вторичных аминов.
4. Результаты таких исследований способствовали бы сокращению списка продуктов, подлежащих контролю, существенному уменьшению затрат на проведение химических анализов, а также расширению сети лабораторий, способных проводить контроль, поскольку он стал бы возможен без привлечения дорогостоящего оборудования.

Литература
1. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический мониторинг суперэкотоксикантов. М.: Химия, 1996. —319 с.
2. Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. // Успехи химии. —1988. —№ . —С. 625—655.  3. Рубенчик Б.Л., Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. Профилактика загрязнения пищевых продуктов канцерогенными веществами. К.: Здоров'я, 1983. —160 с.
4. ДсанПіН 4.4.2.030—1999, К. —2001. —21 с.
5. Hotchkiss J.H. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. —1981. —V. 64, № . —P. 1037—1054.
6. AOAC Official method 982.12. 1995. Supplement March. —1996. —Р. 16—18.
7. Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Методические указания по методам контроля. — М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1993. —16 с.
8. Jasinski J.S. // Anal. Chem. —1984. —V. 56. —P. 2214—2218.  9. Комарова Н.В., Великанов А.А. // Журн. аналит. химии. —2001. —Т. 56, №4. —С. 407—411.
10. Чміль В.Д., Зульфігаров О.С., Юрченко В.В. // Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. №90-98 від 16.03.98. Сб. №30. К., 2001. —С. 11—15.
11. AOAC Official method 991.28. 1995. Supplement March 1996. —P. 12—13.
12. Sen N.P., Seaman S.W., Kushwaha S.C. // Analyst. —1986. —V. 111. —P. 139—144.
13. Fine D.H., Rounbehler D.P. // J. Chromatogr. —1975. —V. 109. —P. 271—279.
14. Budevska B.O., Rizov N.A., Gheorghiev G.K. // J. Chromatogr. —1986. —V. 351. —P. 501—505.
15. Покровский А.А., Медведев Ф.А., Меламед Д.Б. и др. // Журн. аналит. химии. —1978. —Т. 33, №7. —С. 1396—1399.
16. Zni Wang, Hongda Xu, Chenguang Fu. // J. Chromatogr. —1992. —V. 589. —P. 349—352.
17. Klimisch J., Stadler L. // J. Chromatogr. —1974. —V. 90. —P. 223—225.
18. Чмиль В.Д., Зульфигаров О.С., Юрченко В.В. // Журн. аналит. химии. —1998. —Т. 53, №2. —С. 187—190.
19. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. —М.: Химия, 1970. —С. 44.  20. M.B.A.Gloria, J.F.Barbour, R.A.Scanlan. // J. Agric. Food Chem. —1997. —V. 45. —P. 814—816.