УДК 547.231:543

ВИЗНАЧЕННЯ ЛЕГКИХ N-НІТРОЗАМІНІВ МЕТОДОМ ТОНКОШАРОВОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

С.В. Лепіхова, О.М. Голінько, Н.О. Стаднічук

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, м. Київ, Україна

SUMMARY. This paper considers the waves of conversation of the N-Nitrosamines to colour and fluorescent substances and discusses expedient application TLC method for detection carcinogenic N-nitrosamines in food and another objects.

Серед речовин, що забруднюють навколишнє середовище, особливо небезпечні — канцерогени. До таких речовин належать леткі N-нітрозаміни (НА) [1, 2]. За хімічною структурою це аліфатичні та деякі циклічні нітрозаміни. НА легко утворюються за звичайних умов із речовин, що містять азот, та нітрозуючих агентів. Вони можуть міститися в повітрі, ґрунті, воді, мінеральних азотних добривах та отрутохімікатах, косметичних засобах, продуктах хімічної та гумової промисловості, лікарських засобах, кормах, харчових продуктах [3]. Найчастіше виявляють N-нітрозодиметиламін, N-нітрозодиетиламін, N-нітрозопірролідин, N-нітрозопіперидин, рідше N-нітрозодипропіламін, N-нітрозобутиламін, N-нітрозометилетиламін, N-нітрозоморфолін, N-нітрозотіазолідин та ін.

НА досить стабільні. Вони не руйнуються розчинами лугів та розведених кислот, не піддаються дії розсіяного світла, майже не розкладаються при нагріванні до 200—250°С. НА леткі і переганяються з водяною парою [4].

Для визначення НА застосовують спектрофотометричні, полярографічні, газо-хромато-масс-спектрометричні та інші методи. Не втратив значення найбільш простий і доступний метод тонкошарової хроматографії (ТШХ).

Леткі НА слабо забарвлені в жовтий або жовтогарячий колір. Визначення НА за методом ТШХ пов'язане з перетворенням їх на інтенсивно забарвлені речовини або такі, що мають інтенсивну флуоресценцію при опроміненні УФ-світлом.

Ряд запропонованих методів визначення НА був пов'язаний з хімічним перетворенням НА під дією УФ-світла. Це перетворення відбувалось на хроматографічній платівці, яку обробляли відповідним реагентом до або після опромінення.

Хроматографічну платівку обприскували сумішшю розчинів дифеніламіну та хлориду палладію, після чого опромінювали УФ-світлом. Утворювався комплекс: блакитні та фіалкові плями на незабарвленому фоні. Чутливість методу — 1—2 мкг в плямі в залежності від НА [5].

НА визначали також по нітрит-іону, який поряд з вторинними амінами утворюється при УФ-опроміненні. Хроматографічну платівку обприскували реактивом Грісса, після чого слідувала експозиція УФ-світлом. При наявності НА з'являлись забарвлені плями. За цим методом можна визначати 20 мкг/кг НА [6].

За іншим методом після розкладу НА УФ-світлом платівку обприскували нінгидрином. Практичне застосування цей метод знайшов для визначення N-нітрозопірролідину в різних продуктах. Достовірність отриманих результатів була підтверджена хромато-масс-спектрометричним методом [7].

НА можуть бути визначені на хроматографічній платівці як флуоресцентні плями після експозиції платівки УФ-світлом і обробки флуорескаміном [4-фенілспіро-(фуран-2-3Н-1'-фталан)-3,3'діоном]. Чутливість для різних НА — від 10 до 500 нг в плямі [8].

При дії суміші трифтороцтової кислоти та перекису водню, пентафторпербензойної кислоти, суміші персульфату амонію та азотної кислоти НА окислюються без розриву N-N зв'язку, утворюючи нітраміни.

Після перетворення в нітраміни НА визначали за методом двомірної ТШХ в рибі та алкогольних напоях. Чутливість методу — 25 мкг/кг [9].

Під дією гранульованого цинку та соляної кислоти, літійалюмінійгідриду, алюмінію та лугу НА відновлюються до несиметричних гідразинів, які можуть бути перетворені на забарвлені або флуоресцентні сполуки:

Гідразини конденсували з 4-нітроазобензол-4'карбоксихлоридом з утворенням інтенсивно забарвлених сполук, які розділяли ТШХ [10].

За цим методом визначали N-нітрозопіперидин, N-нітрозодиметиламін, N-нітрозодиетиламін у конденсаті тютюнового диму.

Несиметричний гідразин конденсували також з 5-нітро-2-гідроксібензальдегідом. Одержаний жовтий гідразон розділяли ТШХ, елювали метанолом і визначали спектрофотометрично [11]. Забарвлені сполуки одержували також при використанні n-диметиламінобензальдегіду. При взаємодії з 9-антральдегідом утворюються гідразони, які виявляють флуоресцентні властивості, для більшості НА чутливість методу 10—15 нг в плямі [12].

НА денітрозуються мінеральними кислотами з утворенням вторинних амінів. Найбільш ефективний реагент — розчин бромистого водню в льодяній оцтовій кислоті. Відбувається розрив N-N зв'язку і утворюється вторинний амін:

Вторинні аміни, утворені після денітрозування НА, взаємодіють з N-(8-метокси-5-хінолінсульфонил) азиридином (КАЗ) з утворенням флуоресцентних сполук, які визначають за методом ТШХ [13].

У такий спосіб визначали вміст НА в ковбасних виробах, шпику та солоді [14].

Незважаючи на високу чутливість, цей метод не позбавлений суттєвих недоліків. КАЗ має власну флуоресценцію, світло- та термічно нестійкий, схильний до гідролізу [15].

Аміни, одержані в результаті денітрозування НА, утворюють флуоресцентні дансиламіди при взаємодії з 1-диметил-амінонафталін-5-сульфохлоридом (дансилхлоридом) [16].

Дансилпохідні легко розділяються за допомогою ТШХ. Сам дансилхлорид та продукт його гідролізу — сульфокислота мають флуоресцентні властивості, але не заважають флуоресцентному визначенню дансилпохідних амінів. Визначення дансиламідів проводять безпосередньо на платівці при освітленні УФ-світлом або флуоресцентні плями змивають розчинниками і заміряють інтенсивність флуоресценції елюатів. Вказаний метод був використаний для аналізу сирів та інших продуктів.

НА у вигляді дансиламідів визначають також за методом ВЕРХ та масс-спектрометрії. Поряд з дансилхлоридом для одержання флуоресцентних похідних використовують 1-ди-н-бутиламінонафталін-5-сульфохлорид, (бансилхлорид), 1-метил-2-анілінонафталін-6-сульфо-хлорид (мансилхлорид). Аналогічно дансилхлориду реагує з амінами і 2-р-хлорсульфофеніл-3-феніліндон (дисилхлорид).

Для визначення летких НА після стадії денітрозування застосовують також 7-хлор-4-нітробензо-2-окса-1,3-діазол (НБД-хлорид), який реагує із вторинними амінами за схемою:

НБД-хлорид стабільний, не має власної флуоресценції. На відміну від дансилхлориду він не дає флуоресцентних сполук з фенолами, тіолами, спиртами. НБД-похідні НА крім флуоресценції мають жовте, жовтогаряче, червоне забарвлення. НБД-аміни легко розділяються ТШХ. НБД-хлорид та продукт його гідролізу не заважає визначенню. За цим методом аналізували продукти рослинного походження [17], рибні, м'ясні та овочеві консерви [18], воду, свіже м'ясо, картоплю [19], молоко та молочні продукти [20]. Для аналізу НБД-амінів використовують також ВЕРХ та масс-спектрометрію [21].

Запорукою об'єктивності вищезгаданих ТШХ методів, що базуються на перетворенні НА в аміни, є ретельна очистка реактивів та посуду, що використовуються, від амінів та нітрозамінів. Наявність амінів у повітрі лабораторії може вплинути на результат аналізу. ТШХ застосовують також для очистки екстрактів при визначенні НА за іншими методами.

Порівнюючи відомі ТШХ методи визначення НА, можна зробити висновок, що для практичного застосування найбільш придатний метод денітрозування НА сумішшю бромисто-водневої та оцтової кислот з подальшим перетворенням одержаних вторинних амінів на флуоресцентні НБД-хлориди. Названий метод був використаний в нашій лабораторії для аналізу пшениці, жита, а також м'яса та риби. Слід відмітити, що серед проаналізованих зразків не було зареєстровано випадків перевищення гранично допустимого рівня.

ТШХ використовують як метод скрінінга при аналізі великої кількості проб. У разі "позитивного" результату зразок можна дослідити за допомогою більш селективних і чутливих інструментальних методів, таких як ВЕРХ [22], масс-спектрометрія [23], ВЕРХ в сполученні з масс-спектрометром [24], газова хроматографія з використанням хемілюмінісцентного детектора [25] та інших.

Література
1. Рубенчик Б.Л., Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. Профилактика загрязнения пищевых продуктов канцерогенными веществами. —К.: Здоров'я, 1983. —158 с.
2. N-Nitrosocompounds: Occurrence and Biologacal Effect // JARC Sci. Publ. —1982. —№41. —P. 137.
3. N-Nitrosodimethylamine, Concise International Chemical Assessment Document. —Geneva: Vorld Health Organization, 2002. —№38. —45 с.
4 Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. Kанцерогенные N-нитрозамины. Образование, свойства, аналіз // Успехи химии. —1988. —Т.55. —№4. —С. 625—655.
5. Preussmann R., Daiber R., Hengy H. A sensitive Colour Reaction for Nitrosamine on Thinlayer Chromatograms // Nature. —1964. —V. 201. —№49. —P. 502—503.
6. Preussmann R., Neurath G., Wulf-Zorentzen G., Daiber D., Hengy H., Anfaerbemethoden und Dunnschicht Chromatographie von organischen N-Nitrosoverbindungen // Fresenius Zeitschrift fur analytische Chemie. —1964. —Bd. 202. —S. 187—192.
7. Fiddler W., Pensabene J.W., Fagan I.C., Thorne E.I., Piotrowski E.G., Wasserman A.E. The Role of Lean and Adipose tissue on the formation of nitrosopyrrolidine in fried bacon // Journal of Food Science. —1974. —V. 39. —№5. —P. 1070—1071.
8. Young J.C. Detection and determination of volatile and non-volatile N-Nitrosamines by thinlayer chromatography using fluorescamine N-Nitrosocompounds. —JARC Sci. Publ. Lion. —1978. —№19. —P. 63—73.
9. Sen N.P., Claudette D. A Simple Thin-layer Chromatographic Technique for the Semi-quantitative Determination of Volatile Nitrosamine in Alcoholic Beverages // The Analyst. —1972. —V. 97. —P. 216—220.
10. Serfontein W.J., Hurter P., A Method for identifying Small Amount of Nitrosamine in Biological Material // Nature. —1966. —V. 209. —№5029. —P. 1238—1239.
11. Neurath G., Piermann B., Duenger M. Identifizierung von N-Nitroso Verbindungen und asymmetrishen Hydrazinen als 5-Nitro-2-hydroxybenzol-Derivate und Anwendung im Micromabstab // Chemische Berichte. —1964. —Bd. 97. —S. 1631—1636.
12. Young K.W., Brown E.V. A sensitive analysis for nitrosamines // Analytical Letters. —1972. —№5. —P. 293—294.
13. Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье и пищевых продуктах: Методические указания по методам контроля. —М.: Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации, 1993. —11 с.
14. Грачева И.Н., Жукова Г.Ф., Ковельман И.Р., Пимeнова В.В., Точилкин А.И. Флуоресцентный метод определения канцерогенных N-нитрозаминов с применением N-(8-метокси-5-хинолинсульфонил) азиридина // Журнал аналитической химии. —1986. —T.41. —№2. —C. 356—359.
15. Вальтер А.И., Касаткина О.А., Петренко А.Е. К методике анализа нитрозаминов в пищевых продуктах // Гигиена и санитария. —1996. —№ 6. —C. 49—50.
16. Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б., Покровский А.А. Разделение и флуориметрическое определение N-нитрозаминов // Журнал аналитической химии. —1978. —T. 33. —№4. —C. 808—811.
17. Меламед Д.Б., Костюковский Я.Л. Анализ N-нитрозаминов в продуктах растительного происхождения // Вопросы питания. —1978. —№6. —C. 64—68.
18. Меламед Д.Б. Определение N-нитрозаминов в пищевых продуктах, предназначенных для длительного хранения // Вопросы питания. —1979. —№5. —C. 57—61.
19. Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. Выделение и флуоресцентное определение N-нитрозаминов в объектах окружающей среды // Журнал аналитической химии. —1979. —T. 34. —№7. —C. 1358—1363.
20. Меламед Д.Б., Костюковский Я.Л. N-нитрозамины в молочных продуктах // Вопросы питания. —1980. —№4. —C. 70—71.
21. Костюковский Я.Л., Медведeв Ф.А., Меламед Д.Б. Использование продуктов взаимодействия 7-хлор-4-нитробензо-1,3-диазола с аминами для комплексного определения N-нитрозаминов // Журнал аналитической химии. —1980. —T. 35. —№3. —C. 551—557.
22. Зульфигаров О.С., Юрченко В.В., Каширина Н.В., Стадничук Н.А. К вопросу определения N-нитрозаминов в пищевых продуктах // Проблеми харчування. —2004. —№2(3). —C. 64—67.
23. Plomley J.B., Koester C.J., March R.E. Determination of N-Nitrosodimethylamine in complex Environmental Matrices by Quadrupole Ion Storage Tandem Mass Spectrometry Enhanced by Unidirectional Ion Ejection // Analytical Chemistry. —1994. —V. 66. —P. 4437—4443.
24. Volmer D.A., Lay J.O., Billedeau S.M., Vollmer D.l. Detection and Confirmation of N-Nitrosodialkylamines Using Liquid Chromatography-Electrospray Jonization Coupled On-Line with a Photolysis Reactor // Analytical Chemistry. —1996. —V. 68. —P. 546—552.
25. Tomkins B.A., Griest W.H. Determination of N-nitrosodimethylamine at Part-per-Trillion Concertrations in Contaminated Groundwaters and Drinking Water Featuring Carbon-Based Membrane Extraction Disks // Analytical Chemistry. —1996. —V. 68. —P. 2533—2540.