УДК 616-056.52+616-056.3+616.379-008.64)-07:621.384.668.8:612.392/.398:577.2

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МЕДИЦИНА: МЕТОДЫ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА В НУТРИЕНТОЛОГИИ И В СТРАТИФИКАЦИИ ВЫСОКОГО РИСКА УХУДШЕНИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ

Залесский В.Н.¹, кандидат мед. наук, Великая Н.В.², кандидат мед. наук, Дынник О.Б.3, кандидат мед. наук

¹Национальный научный центр "Институт кардиологии
им. академика Н.Д. Стражеско" АМН Украины, Киев
²Национальный медицинский университет им. академика А.А. Богомольца, Киев
³Медицинское научно-практическое объединение "Медстрой", Киев

SUMMARY. In this article the analysis of modern data about use of methods of proteomic food analysis in the nutrientology are presented. Their main characteristic is given as well as modes of their application in quantity and quality control of protein contain (their metabolites) and safety of foodstuffs.
The perspective of use of methods of proteomic food analysis in digestive health diabetes, immunity, allerge and food preference are displayed.

Введение. На рубеже XX–ХXI веков отмечено поступательное развитие исследований, касающихся проблемы питания, начиная с изучения роли различных нутриентов пищи, их влияния на уровень популяционного здоровья и до промоции общественного здоровья через оптимизацию диетических программ отдельных категорий населения. Современные нутриентологические исследования полагают оптимизировать процесс улучшения индивидуального здоровья и предупреждения роста заболеваемости в рамках популяционных групп, и фокусируют основное внимание ученых на проблемах влияния внешнесредовых токсических факторов и стресса на организм человека, а также на методах их контроля. Правильное питание предполагает достижение поставленных целей, связанных с эффективной регуляцией метаболизма в организме, усилением процессов активной и пассивной его защиты, а также делает возможной оптимальную адаптацию в соответствии с индивидуальными потребностями человека. Развитие данной концепции постоянного усовершенствования нутриентной поддержки организма или его потребности в функциональном питании способствовало лучшему пониманию механизмов профилактики заболеваний, эффективной диагностике биомаркерных молекул, а также их успешному использованию в условиях клиники. Итогом развития нутриентологической науки явилось появление новых дисциплин, в частности нутригенетики [2] и нутригеномики [1]. Основы нутригеномики позволили выявить особенности влияния нутриентов на транскрипцию генов, экспрессию белковых молекул генома и их метаболизм [3]. Отсюда следует правомочность употребления таких дефиниций, как протеомика, метаболомика и диетомика при анализе фенотипа здоровья [4]. Основы нутригеномики углубили наши знания о нутриентзависимом однонуклеотидном полиморфизме генов и феномене эпигенетического развития в условиях различной индивидуальной чувствительности к комплексным диетическим программам [5]. В работе представлен анализ современных данных об использовании методов протеомного анализа в нутриентологии. Дана их характеристика и способы применения в контроле качественного и количественного состава белков и их метаболитов в продуктах питания при диабете, ожирении, аллергических и других состояниях организма человека.

Становление и развитие протеомных биотехнологий для анализа биомаркерных молекул в нутриентологии. Протеомика — основное направление функциональной геномики [6], в рамках которого возможно осуществление высокоточного анализа продуктов экспрессии генов и скрининга биомаркерных молекул, в том числе и в нутриентологии. Развитие технологий протеомного анализа инициировало существенный прогресс в формировании инструментальной базы для молекулярной диагностики целого ряда соматических болезней, нашедших применение в клинике [7–10]. Это позволило многим ученым выдвигать предположения о важном значении конкретных белковых субстанций, циркулирующих в кровотоке в качестве биомаркеров как физиологических, так и патологических состояний. Существенным подтверждением данной гипотезы послужило обнаружение биомаркеров рака [11], сердечно-сосудистых [12], ревматических [10] заболеваний, белковых продуктов клеточного обмена, а также других биоаналитов в условии клиники [13].

В протеомном анализе применяется комбинация двух методов: двухмерного (2Д) капиллярного электрофореза (СЕ) и масс-спектрометрии (МS) белковых макропроб с последующей обработкой результатов методом биоинформатики [14]. Одной из наиболее перспективных модификаций протеомной технологии является комбинация методов MALDI-Tof ("Matrix Assistant Laser Desorb Ionization Time of fligtle") [15]. Принцип этого подхода заключается в том, что белки из неокрашенного LD-геля электроблоттингом переносятся на мембрану с иммобилизированным трипсином, в котором они расщепляются до белковых фрагментов. Полученные белковые фракции улавливаются второй мембраной, которая считывается в MALDI-Tof тандемном (MS-MS) масс спектрометре и позволяет прочитывать последовательность пептидов со скоростью сотен образцов в час. Используется обратная фаза (LS) для разделения пептидов из чрезвычайно сложных смесей с целью определения аминокислотных остатков в белковых молекулах.

Перспективными, с точки зрения протеомной технологии анализа биомаркерных молекул в нутриентологии, являются белковые микрочипы, созданные на основе технологии SELDI ("Surface Euhauced Laser Desorbtion Ionization") [16]. Этот метод имеет определенные преимущества перед другими технологиями (жидкостная хромато-масс-спектрометрия, LC-MS; 2D-капиллярный электрофорез в геле; обратнофазовая высокоразрешающая жидкостная хроматография, HPLC; метод ELISA и др.) из-за его высокой чувствительности (фемтомолярный диапазон) и легкой адаптации к диагностическому формату [16]. Для удобств интерпретации достигнутых результатов компания "Ciphergen" поставляет специальный программный пакет, который представляет данные масс-спектрометрического определения, зафиксированного на хроматографическом носителе биоматериала в виде денситограмм с указанием "интенсивности" каждой пробы масс-спектрометрического пика ионов анализируемых белков. Необходимо отметить, что сегодня существенно расширена граница оценки масс-спектров, анализируемых с применением технологии SELDI (до 250 кДа). Это позволяет использовать SELDI в медицинских учреждениях без специальной подготовки персонала в области масс-спектрометрии. В литературе имеются сообщения об успешном применении разработок компании "Ciphergen" для обнаружения биомаркерных молекул в составе патологических комплексов в жидких средах организма больного [17].

Кроме описанного выше варианта белковых чипов, являющегося, по существу, примером удачного применения многомерной хроматографии, существуют многочисленные разработки, направленные на замену дорогостоящей многоэтапной процедуры анализа белков на высокопроизводительные и сравнительно недорогие системы для лабораторного и клинического применения. Первая группа разработок касается создания миниатюризированных устройств по аналогии с ДНК-чипами [18], которые используют моноклональные антитела (МКАТы) или их аналоги — аптамеры (одноцепочечные антитела) [19] для построения микроплатформ на известные маркеры, определяемые в настоящее время традиционными методами биоанализа. Одной из лидеров в этой области является голландская фирма "Glancus Proteomics", известная производством широкого круга МКАТов практически для всех экспрессируемых белков человека с последующим нанесением их на твердую фазу и анализом в формате микро-ИФА9. В продаже имеются белковые микрочипы для определения цитокинов, фосфатаз, белков воспалительного процесса и др. Планируется выпуск панелей белковых микрочипов, позволяющих количественно определять набор из нескольких сотен белков, имеющих клиническое значение, предположительно к 2007 г. [19].

Биосенсорные технологии представляют собой инновации на стыке биологии и электроники. Биосенсоры — новый класс аналитических устройств, использующих иммобилизированные биологические материалы для "узнавания" молекул [20]. Впервые идею создания биосенсорного устройства выдвинули около 30 лет назад Clark&Lyonns (цит. по [20]). Эта идея состояла в использовании ферментного электрода — электрохимического датчика с иммобилизированным на его поверхности ферментом. За прошедшие десятилетия были реализованы многочисленные разработки по различным аспектам электрохимии белков на поверхности электрода, что привело к созданию ряда биосенсоров на основе ферментных электродов, часть из которых получила промышленную реализацию. Основные типы биосенсоров подразделяются, в зависимости от биочувствительности элемента, на ферментные, иммунологические, микробные, а от типа детектора — на электрохимические, оптоэлектронные, акустические, оптические и др.

Основное преимущество, заложенное в этой биотехнологии, заключается в том, что определенный аналит можно исследовать в сложной смеси, не прибегая к дополнительным манипуляциям, связанным с использованием химических реагентов (безреагентные методы анализа) [20]. Кроме того, измерение происходит практически мгновенно. Так, например, время отклика разработанного амперометрического ферментного биосенсора для определения в биопробах глюкозы, гормонов, а также лекарственных и пищевых белковых метаболитов составляет 10 с. [21]. Из биосенсорных технологий, получивших коммерческую реализацию, наиболее перспективным (наряду с амперометрическими ферментными электродами с повышенной чувствительностью) являются аффинные биосенсоры с оптическим, парамагнитным и электромагнитным детектированием и биосенсоры на основе синтетических рецепторов [22].

Функционально современные биосенсоры сопоставимы с биорецепторами клеток, способными воспринимать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, включая факторы продуктов питания. Lennox и соавт. (цит. по [20]) разработали высокочувствительный, высокоскоростной планарный микробиосенсор и методику его применения для определения лиганд-рецепторных взаимодействий. Поверхность рабочего электрода биосенсора модифицирована монослоем длинноцепочечного углевода. В монослой включены молекулы пептида, состоящие из 2-х субъединиц, одна из которых связана с подложкой биосенсора, другая — с молекулой лиганда. При связывании последнего со специфическим рецептором происходит изменение электрической проводимости монослоя.

И, наконец, разработан волоконно-оптический флюорометрический мультиклеточный биосенсор для одновременного эксспрес-анализа многочисленных биологических компонентов в одной пробе с целью осуществления их мониторинга. Устройство включает пучок оптических волокон, на торце которых в микрополостях иммобилизированы различные типы клеток, специфически откликающиеся изменениям флюоресценции на воздействие аналитов в образце [20].

Сегодня протеомика — область интенсивных исследований, включающих идентификацию биомаркерных молекул при различных заболеваниях, в том числе онкологических, кардиологических, ревматологических, гепатологических и др. [8–12, 23]. Аналогично этому, для нутриентологии оказались весьма полезными исследования протеомного профиля жидких сред организма, в т.ч. сыворотки [24], плазмы крови [25], мочи [26], слюны [27], слезной жидкости [28] на предмет обнаружения физиологических и диагностических концентраций маркерных белков. Проведение протеомного анализа большинства жидких сред организма оказалось необходимым для неинвазивного контроля биологических эффектов, вызываемых многими ингредиентами пищи.

Разработка механизмов влияния различных нутриентов пищи с целью профилактики и лечения заболеваний человека на уровне индивидуального здоровья еще только начинается. Однако научно обоснованное их комплексное использование может позволить уже сейчас, с одной стороны, удлинить сроки продолжительности высокого качества жизни. С другой стороны, оказывая более "мягкое" регуляторное влияние на уровень внутриклеточной сигнализации по сравнению с фармпрепаратами, рационально подобранный профиль нутриентов в составе диет может оказать более физиологическое (безопасное) действие при появлении ранних признаков заболевания, а также нутриенты пищи могут оказаться более безопасными в случае постоянного приема (по сравнению с фармпрепаратами) при далеко зашедших стадиях болезни [29]. К тому же нутриентологические аспекты здорового образа жизни не ограничиваются только дефиницией соматического здоровья на молекулярном уровне, но также включают и существенную роль биомаркерных молекул ранних патологических изменений, поиск которых осуществляется с целью проведения нутриентзависимых таргетных стратегий в условиях клиники.

Динамика белкового обмена традиционно вызывает большой интерес у специалистов по проблемам питания. Существенный рост и развитие целого ряда заболеваний человека трудоспособного возраста, а также процессы ускоренного старения у пожилых в значительной мере зависят от альтеративных изменений биосинтеза, метаболизма, функциональной активности белковых молекул. В традиционные методы их оценки в нутриентологии входят, в частности, методы протеомных исследований (мечение радиоизотопами аминокислот in vivo) с последующим мониторингом их инкорпорирования и количественного накопления в структуре тканевых белков [30].

Однако, новые возможности открываются в нутриентологии при использовании методов протеомного анализа белковых метаболитов в продуктах питания, что впервые было показано при комплексном изучении обмена бактериальных белков в пище [31]. Используя биотехнологию протеомного анализа аминокислот в исследованиях прогрессирующего роста простатических опухолевых клеток культуры тканей, Everley и соавт. [32] обнаружили в микросомальной фракции более 440 белковых метаболитов, обладающих различным метастазирующим потенциалом.

Нутриентный дисбаланс — важнейший предиктор развития многих нутриентдефицитных состояний. Традиционно специфические концентрации нутриентов рассчитывались на основании критерия усредненного нутриентного статуса человека. К сожалению, необходимая информация о нутриентном уровне регулируется сегодня диетическими рекомендациями на уровне популяции и определяется уровнем содержания того или иного нутриента в пищевых продуктах [3].

В настоящее время на основе современных представлений о нутриентном фенотипе [33], а также роли генетических, эпигенетических и нутриентологических факторов в его формировании становится более понятным молекулярный механизм действия нутриентов и их влияние на биологические мишени в клетке. На этом пути развития нутриентологии протеомные исследования могут оказаться крайне необходимыми в качестве всеобїемлющего подхода в изучении комплексной модели нутриентного статуса человека.

Методы протеомного анализа в контроле качественного, количественного состава белков и безопасности продуктов питания. Современный контроль количественного и качественного состава, а также безопасности пищевых продуктов, проведение мониторинга для стратификации повышенного риска возникновения токсических соединений в продуктах питания становятся все более актуальной медико-социальной проблемой. Эффекты генетической чистоты, неправильного хранения, транспортировки и других факторов на химический, биохимический состав продуктов питания также является важнейшей проблемой науки о питании [34]. В то же время контроль сроков годности, условий хранения продуктов является фундаментальной проблемой соматического здоровья потребителей. Поэтому применение биоаналитических методов протеомных исследований образцов воды, напитков, фруктов, мясо-молочных продуктов и др. является актуальной и современной мерой их безопасности для здоровья человека от последствий микробной контаминации, биоокисления, изменений аминокислотного состава, запаха (профиля ароматизации) в процессе изготовления, обработки, транспортировки и хранения продуктов питания.

В индустрии создания продуктов питания их аминокислотный состав является важнейшим детерминантом процессов обработки, ферментации, хранения и существенно влияет на уровень качества конечного продукта. В целях биологического анализа состава аминокислот применяются сочетанные технологии (капиллярный электрофорез — масс-спектрометрия "CE-MS") протеомных исследований с использованием опции SLI ("Sheath liguid interface") в области микромолярных концентраций [35, 36]. Комбинированная методика разделения веществ, в формате (СЕ-кислотный буфер +MS-деттирование в условиях ESI-"electrospray ionization"), позволяет провести одновременный анализ аминокислот (до 32-х) в одном исследовании [36]. Данная (CE-ESI-MS) технология была использована для идентификации аминокислотного профиля белковых продуктов из сои и их метаболитов (в результате ферментативной обработки) [37]. В дальнейшем было выявлено количественное содержание аминокислот биоаналитическим методом протеомного анализа в фруктовых соках, овощах и некоторых мясных продуктах, подтвержденное расчетным путем [38, 39].

Сравнительно недавно CE-ESI-MS метод стал применяться для анализа D- и L-вращающих изомеров аминокислот с целью обнаружения просроченных образцов апельсинового сока посредством добавления синтетических Д-вращающих производных аминокислот в исследуемые образцы продуктов питания [40]. При этом процесс дериватизации аминокислот удалось осуществить благодаря использованию FITC и DNS ("densyl chloride") соединений сепарантов, с целью усиления масс-спектрометрических полезных сигналов, для снижения коэффициента (SIN) сигнал/шум. Данная биоаналитическая методика позволила выявить полный метаболический профиль просроченного апельсинового сока, что способствовало разделению основных семи (хиральных) аминокислот ("Arg, Pro, Asn, Ala, Ser, Glu, Asp"), а также GABA ("g-aminobutiric acid") от семи метаболитов в одном образце апельсинового сока. Оптимизация данной биотехнологии способствовала завершению процедуры одновременного протеомного (CE-MS) анализа в одном сравнительном исследовании сразу 2-х коммерческих образцов (натурального и поддельного апельсинового сока) на основе использования синтетических аминокислотных добавок, содержащих D- и L-формы, а также выявлению фальсифицированных продуктов питания (разбавление водой фруктовых соков) [34].

Другим примером эффективного биосинтетического контроля качества и безопасности продуктов питания послужил протеомный (CE-MS) анализ лизоцима — белка животного происхождения, выделенного из мяса цыплят и черных индюшек [41]. В данном исследовании разделение белков проводили перед процедурой углубленной CE-MS идентификации путем комплементарного усреднения их молекулярной массы для адекватного распознавания и разделения по степени седиментации. В ряде случаев этот белок действует в качестве потенциального аллергена, вызывая аллергические реакции. Методом CE-MS протеомного анализа [41] выполняли быстрое детектирование лизоцима в образцах винных изделий, в концентрации, достигающей ~1,3 мг/мл. Отмечено, что наличие микробных контаминантов яиц или фальсификации некоторых продуктов питания способствовало повышению риска возникновения аллергических реакций у потребителей [34].

Биоаналитические технологии анализа сахаров (арабиноза, рибоза, ксилоза, галактоза, глюкоза, фруктоза, маннитол, инозитол) успешно применялись для их разделения с помощью CE-ESI-MS процедуры, основанной на использовании кислотного буфера для CE сепарации и MS детектирования в ESI-формате [42]. Подобный биоаналитический метод был использован для идентификации и быстрого разделения олигосахаридов в микстуре на основе применения гидрофобных монолитных капиллярных колонок [43] и Фурье-анализа спектров синтетических углеводов в образцах пищевых продуктов [44].

Флавоноиды — полифенольные соединения, содержащиеся во многих продуктах питания и фруктовых напитках, в последние годы вызывает повышенный интерес благодаря благоприятным эффектам на соматическое здоровье. Это связано с их антиоксидантным, антиаллергическим, противовоспалительным и антивирусным действием. В некоторых эпидемиологических исследованиях подтверждено их благоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему, а также установлен их бимодальный эффект на процессы клеточного роста и развития [45]. Aramendia и соавт. [46] представили удовлетворительные результаты количественного и качественного CE-ESI-MS протеомного анализа микстуры изофлавонов, в котором описали модифицированную методику выделения высокоочищенной формы нарингенина из ароматических растений [47].

Другие природные компоненты пищевых продуктов растительного происхождения, содержащие фенольные молекулы, были выделены и идентифицированы методом CE-MS анализа [48]. Так, проведенное сравнение между методами (HPLC-ESI-MS и CE-ESI-MS) биологического анализа фенольных компонентов в образцах красных сортов вина показало, что CE (по сравнению с HPLC) формат обладал более высокой эффективностью при одновременной идентификации 24-х фенольных соединений, содержащихся в экстрактах красных марочных вин [48].

Особый интерес в последние годы вызвал протеомный анализ "даров" моря ("sea food") благодаря наличию в их составе высокотоксичных компонентов, содержащихся в продуктах морской фауны и флоры. Так, PSP ("paralitic shellfish poisoning") нейротоксин входит в большую группу (более 20-ти) нейротоксических соединений (производных сакситоксина) и является продуктом простейших ("dinoflagellates") микроорганизмов, составляющих основную часть океанического планктона. Степень выраженности токсического эффекта, обусловленного количеством контаминантов, содержащихся в морепродуктах, связывают с возникновением паралича дыхательных движений.

Комплекс проблем со здоровьем, связанных с этим видом контаминантов пищи, обуславливает необходимость своевременного проведения биоаналитического контроля количественного содержания нейротоксинов в морепродуктах. Так, использование протеомной CE-MS конфигурации для анализа образцов продукции аквакультуры [50] позволило обнаружить наряду с PSP нейротоксином также акадаиковую кислоту ("acadaic acid") и демоиковою кислоту ("demoic acid"), которые обладают высокотоксичными свойствами. CE-ESI-MS протокол протеомного анализа помог выявить и идентифицировать декарбамиловые производные PSP нейротоксина [49].

Модификация метода капиллярного изотахофореза ("CITP") в сочетании с CE-ESI-MS анализом позволила выявить микромолярные концентрации PSP-нейротоксина в мышечной ткани морских ракообразных (крабы, устрицы). Данная модификация метода позволила произвести протеомный анализ экстрактов мякоти двухстворчатого моллюска, содержащего PSP-нейротоксин на уровне даже ниже, чем 100 нмоль.

Другим токсином, содержащимся в секрете слюнных желез некоторых видов волнистых моллюсков, является тетрамин ("tetramethyl ammonium"). Протеомный анализ (CE-ESI-MS) выявил количественные различия в содержании данного токсина между двумя образцами волнистых моллюсков из Канады и Японии. На масс-спектрах ионного состава образцов тканей зарегистрированы следовые количества также других соединений, таких как холин и его токсические метаболиты [51]. Прочие токсические соединения, в частности микроцистины, имеющие пептидную структуру, обнаружены у некоторых видов морских водорослей ("alge"). Оказалось, что они ингибировали печеночные функции и могли являться промоутерами опухолевого роста у человека [51].

Многие гетероциклические ароматические амины (HAs) с выраженными токсическими свойствами и пищеассоциированной канцерогенной, мутагенной активностью были зафиксированы в богатых белками продуктах (жаренная свинина, говяжья печень). Их образование связывалось с температурным фактором, а также повышенным содержанием предшественников HAs и ингибиторов HAs в необработанных продуктах. Различный дизайн протеомных CE-MS исследований позволил идентифицировать полный состав этих компонентов. Zhao и соавт. [52] усовершенствовали процедуру CE-MS определения HAs в концентрациях близких 50 нг/г ткани, при использовании (PVA) капиллярных колоночных систем, позволяющих выполнить сравнительно быструю пристеночную абсорбцию HAs токсинов. В дальнейшем Sentellus и соавт. [53] удалось в одном образце CE-ESI-MS методом идентифицировать 16 HAs соединений на уровне их концентрации =<10 нмоль. Эти данные были подтверждены другими исследованиями [54].

К экзогенным соединениям, накапливающимся в продуктах питания, относятся хорошо изученные ранее, в том числе и методами протеомного анализа, пестициды, аммониевые и триазиновые производные гербицидов, хлорофенолы, фунгициды, а также другие экзогенные токсины, антибиотики, канцерогены и др., которые подробно описаны в соответствующих обзорных исследованиях [55, 56, 57].

Следует отметить, что за последние 5 лет количество протеомных исследований в науке о питании существенно возросло, что открывает в будущем широкие возможности их применения в качестве методов рутинного анализа качества и безопасности пищевых продуктов. Наряду с этим интенсивно развивается инструментальная и методологическая база протеомных исследований в нутриентологии, что позволяет ликвидировать некоторое отставание в этой области знаний в ближайшие годы.

Клинические аспекты протеомных исследований продуктов питания. За прошедшие 20 лет данные ВОЗ о неуклонном росте аллергических реакций у населения планеты позволили говорить о них как об эпидемии XXI века. Результаты популяционных исследований подтверждают высокие показатели возникновения аллергических реакций у детей и подростков в результате употребления молочных продуктов питания (2–3%), а также аллергических реакций после приема яиц (2,6%) у детей старшего возраста. В целом, глобальный уровень аллергии, по данным ВОЗ, составляет от 6 до 8% [34].

Аллергию, в широком понимании, связывают с IgE-модулированным ответом организма на действие аллергена [58] на фоне появления различной степени выраженности манифестных симптомов, в том числе таких, как нейродермит и астма. Классификация аллергенов соответствует каналам их взаимодействия с системами организма человека, включая аллергены из воздушной среды, действующие через систему дыхания; пищевые аллергены, действующие через систему пищеварения; контактные аллергены, действующие через кожу и слизистые оболочки. Однако существуют пищевые аллергены, инициирующие реакции со стороны респираторной системы у человека [58].

Процессы аллергии, главным образом, находятся под контролем кооперации Th2 клеток, которые экспрессируют интерлейкины (ILs) 4,5,6,13. Аутоиммунные процессы контролируются Th1 клетками, экспрессирующими IL-2, IL-12, IL-18, интерфероны альфа (IFN-a) и гамма (IFN-g), а также факторы некроза опухоли (TNF a, b).

Сравнительно недавно открыты Т-регуляторные клетки (Т_reg s), которые секретируют IL-10 и TGF-b факторы, необходимые для контроля баланса между активностью Th1 и Th2 клеток, а также регуляции каскадов специфической антигенной реакции и поддержания иммунного ответа в условиях физиологической нормы [59]. Известно, что главным дифференциальным фактом между иммунным статусом организма в норме и аллергическим состоянием является то, что при аллергических реакциях регистрируются пониженные уровни содержания Т_reg-клеток, что приводит к дерегуляции реакций специфических антигенов [34].

К главным маркерам аллергических реакций из общего их числа (?20) относят IL-10 [60], TGF-b, TLR s [61], PD-1 и CTLA-4 [62]. Однако в качестве индикатора аллергической сенсибилизации оценивается уровень IgE. Сегодня остаются малоизученными маркеры генетической предиспозиции, отвечающие за аллергическую чувствительность. Однако известно более 150 генов, предположительно контролирующих выраженность трех аллергических состояний, обусловленных клиникой нейродермита, сенной лихорадки и астмы [63], прогрессирование которых у отдельных индивидов связывается с их комбинациями.

Многие аллергены удалось идентифицировать методами протеомного анализа. Так, протеомный профиль аллергенов был установлен для зерен арахиса, семян кунжута [65], мяса креветок [66]. При этом общее количество аллергенов превысило два десятка белковых молекул. Однако протеомный профиль был существенно расширен благодаря исследованию содержания аллергенов в таких продуктах питания, как рыбное филе, яичный желток, крабовое мясо, молоко, соя, зерна пшеницы, земляной орех и др. Оказалось, что многие наиболее важные аллергены являются белковыми метаболитами ингредиентов пищи животного и растительного происхождения. Поэтому источники аллергического риска требуют мониторинга до, в процессе и после обработки пищи [67], что особенно актуально в производстве молочного питания для детей.

Протеомный MALDI-Tof масс-спектрометрический анализ оказался чрезвычайно показательным инструментом для обнаружения вызывающих аллергию субстанций в продуктах из коровьего молока [68]. Последующие исследования [69] включали идентификацию различных белковых субстанций в натуральном молоке с превышенным сроком хранения и белковых метаболитов в продуктах сыроварения. В коровьем молоке, сыворотке и молозиве идентифицировано большое количество вызывающих аллергию низкомолекулярных белковых соединений [70]. В этом исследовании отмечены существенные различия в содержании низкомоллекулярных белковых фракций между молозивом и натуральным молоком. В число низкомолекулярных белковых соединений, обнаруженных только в молозиве, входит фибриноген b_с, хитиназа, альфа-антитрипсин, комплемент (С3-альфа), гемосолин и аллопротеин Н. С другой стороны, альфа-лактоглобулин и бета-лактоглобулин, а также сывороточный бычий альбумин, серотрансферрин и лактоферрин были идентифицированы как в натуральном молоке, так и в составе молозива [71].

Интересно отметить широкие возможности использования в нутриентологии анализа протеомного профиля липидной фракции грудного молока, состоящей из триглицеридов, включенных в глобулярный мембранный комплекс (MFGM). MFGM является производным клеток железистого эпителия апикальных протоков молочных желез и используется для построения липидных субъединиц в составе грудного молока, которое является важнейшей составляющей детского питания. MFGM входит в состав мембраносвязанных молекул (муцина, лактогерина, адипофилина, CD36 и бутирофилина) [73] и может принимать участие в биосинтетических внутримембранных процессах в клетке. Поэтому выделение и идентификация новых белковых комплексов в составе грудного молока методами протеомного анализа — это одна из актуальных научных проблем в науке о питании.

В рамках исследований, касающихся функциональной геномики, было секвенировано более 90 микробных геномов. Наряду с этим, еще более 180 микробных геномов находятся на этапе их расшифровывания [74]. Кроме этого, значительный интерес к патогенным микроорганизмам возник благодаря систематическому изучению геномных и протеомных профилей пробиотиков — живых бактерий, присутствующих в значительных количествах и успешно выживающих в среде кишечника, оказывая положительное действие на организм хозяина, а также вызывая бифидо- и лактогенный эффекты [75].

Отмечена важная роль пробиотиков в контроле механизмов развития системного воспаления, редукции риска аллергических реакций, нормализации иммунного гомеостаза желудочно-кишечного тракта, предупреждении развития инфекционных процессов в диареи [76, 77, 78]. Кишечная микрофлора играет важную роль в регуляции иммунного статуса. Сравнительные особенности микроорганизма кишечника у практически здоровых и у младенцев, страдающих аллергией, показали, что последние имеют незначительные количества лакто- и бифидобактерий, но больше клостридий и колиформ [79]. Это свидетельствует о том, что пробиотики инициируют обратное развитие и минимизацию активности IgE-зависимых аллергических реакций [80], они также вовлечены в процесс реструктуризации толерантности к пищевым аллергенам даже после сенсибилизации [81].

В "пионерских" исследованиях Hooper и соавт. [82] отмечены широкие возможности методов транскриптомного анализа микроорганизмов с целью промоции благоприятных эффектов пробиотиков. Авторы использовали биотехнологии белковых микрочипов для контроля процесса колониеобразования B. thetaiotimicron в желудочно-кишечном тракте мышей. Оказалось, что гены, контролирующие процессы в клетках желудочно-кишечного тракта, в частности, такие как: абсорбция нутриентов, функционирование барьерных механизмов мембран энтероцитов, ангиогенез — также участвовали в контроле регуляции микробного колониеобразования.

Впервые MALDI-Taf-MS контроль был использован в биоаналитическом исследовании белковых субъединиц продуктов жизнедеятельности интактных бактерий желудочно-кишечного тракта [83]. Методом MALDI-Taf-MS анализа с помощью детектора селективных ионов исследователи получили масс-спектры белков (и их субъединиц) — продуктов метаболизма пробиотиков, являющихся биомаркерами функционального состояния конкретных микробных штаммов [83]. Профиль экспрессии белков как пребиотиков, так и пробиотиков удалось зарегистрировать методом MALDI-масс-спектрометрического анализа [84]. Спектральная идентификация белковых компонентов грам-положительных и грам-отрицательных микроорганизмов кишечника проведена на основе MALDI-Taf-MS сканирования клеточной стенки бактерий кишечника [85]. Отмечены молекулярные изменения в белковом профиле пробиотиков, в результате влияния внешнесредовых факторов, методом SELDI-масс-спектрометрического анализа [86].

В последнее время возросло количество научных коллективов, разрабатывающих проблемы протеомных исследований в области диабетологии и контроля избыточной массы тела. Итоги по этим направлениям исследований подведены на последних двух Европейских форумах научных групп: 1) NUGENOB ("Nutrition, GENes and OBesity") [87] и 2) DIOGENES ("DIet, Obesity and GENES") [34].

Итоговые рекомендации этих консорциумов специалистов, касающиеся протеомных исследований в нутриентологии, включали:
- осуществление поиска по выявлению и идентификации новых нутриентчувствительных кандидатных генов, контролирующих избыточную массу тела;
-осуществление протеомного анализа высоко- и низкокалорийных диет;
- выявление эффектов дисфункции кандидатных генов в ответ на физиологически значимые внешнесредовые стимулы у пациентов с избыточной массой тела методами геномно-протеомного анализа;
- поиск предикторов ожирения методами молекулярно-генетического анализа;
- оптимизацию диетических программ, влияющих на уровень секреции специфических белков клетками жировой ткани.

Также обращено внимание ученых на необходимость проведения комплексных протеомных исследований с целью идентификации биомаркерных молекул в плазме крови (цитокины, адипокины и др.) для оптимизации нутриентного статуса в условиях клиники с помощью современных методов молекулярной диагностики на основе протеомных платформ и мультиплексного иммуночипирования.

Література
1. Смоляр В.І. Сучасний розвиток нутригеноміки // Проблеми харчування. —2004. —№4. —С. 8–4.
2. Залесский В.Н., Великая Н.В., Дынник О.Б. Молекулярные механизмы нутриентзависимой регуляции экспрессии генов и стабилизация ДНК: основы диетомики // Проблеми харчування. —2006. —№ 31. —С. 17–21.
3. Arab L. Individualized nutrition recommendations do we have measurements needed to assess risk and make dietary recommendations // Proc. Nutr. Soc. —2004. —Vol. 63. —P. 167–173.
4. Van Ommen B., Stierum R. Genetics vs. Genomics in practice: the contineeum from genetic disease to genetic information in health and disease // Curr. Opin. Biotechnol. —2002. —Vol. 13. —P. 517–524.
5. Mathers J. C. The biological revolution — towards a mechanistic understanding of the impact of diet on cancer risk // Mutat. Res. —2004. —Vol. 551. —P. 43–51.
6. Brownstein M. J., Khodursky A. Functional Genomics. —Humana Press. Totowa, 2003. —272 p.
7. Anderson N.L., Anderson N.G. The human plasma proteomic: history, character and diagnostic properties // Mol. Cell Proteomics. —2002. —Vol. 1. —P. 845–867.
8. Залесский В.Н., Дынник О.Б. Молекулярная медицина: Протеомные диагностические технологии и методы молекулярной терапии // Врач. дело. —2005. —№1. —С. 3–10.
9. Залесский В.Н., Нудченко А.О., Дынник О.Б. Оценка диагностических методов протеомного анализа плазмы при проведении допинг-контроля у спортсменов // Спортивная медицина. —2006. —№1–2. —С. 78–89.
10. Дынник О.Б., Залесский В.Н. Современные биоаналитические (протеомные) технологи в лабораторной диагностике ревматических заболеваний //Укр. ревматол. журн. —2006. —№2. —С. 17–24.
11. Petricoin E.F., Ardekani A.M., Hitt B.A. et al. Use of proteomic patterns in seriun to identify ovarian cancer // Lancet. —2002. —Vol. 359. —P. 572–577.
12. Залесский В.Н., Дынник О.Б. Особенности протеомного профиля плазмы больных в исследовании кардиоваскулярных биомаркерных молекул // Укр. кардиол. журнал. —2006. —№6.
13. Robertson E.A., Van Steirteghem A.S., Byrkit J.A. et al. Biochemical individuality and the recognition of personal proteomic profiles with computers // Clin. Chem. —1980. —Vol. 26. —P. 30–36.
14. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика, протеомика —науки о жизни. // Вопр. мед. химии. —2000. —Т. 46. —№1. —С. 3–7.
15. Stomakhin A.A., Vasiliskov V.A. DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchips: MALDI mass spectrometry identification // Nucl. Acid Res. —2000. —Vol. 28. —P. 1193–1198.
16. Issag H.J. The SELDI-Tof MS approach to proteomics: protein profiling and biomarker identification // Biochtm. Biophis. Res. Commun. —2002. —Vol. 292. —P. 587–592.
17. Uchida T., Fukawa A., Uchida M. et al. Application of a novel protein biochip technology detection and identification of biomarkers in synovial fluid // J. Proteome Res. —2002. —Vol. 1(1). —P. 495–499.
18. Мирзабеков А.Д., Прокопенко Д.М., Четкин В.Р. Применение матричных биочипов с иммобилизированной ДНК в биологии и в медицине // Информационные медико-биологические технологии / Под ред. В.А. Князева, К.В. Судакова. —М.: ГОЭТАР-МЕД, 2000. —С. 166–198.
19. Guthrie J.W., Hamula C.L., Zhang H.Q. Assays for cytokines using aptamers // Methods. —2006. —Vol. 38(4). —P. 324–342.
20. Варфоломеев С.Д., Евдокимов Ю.Н., Островський М.А. Сенсорная биология, сенсорная біотехнологія // Вестн. РАМН. —2000. —Том 70, №1. —С. 21–30.
21. Chixiaw-fei S.Q. Diochip technology // Yichuan Hereditus. —2001. —Vol. 23. —P. 370–374.
22. Turner G.A. N-glucosylation of serum protein and its proteomic (biochip) investigation using lectin // Clin. Chim. Acta. —2002. —Vol. 422. —P. 193–197.
23. Diamond D.L., Proff. S.C., Jacohs J.M. et al. Hepatoproteomics: Applying proteomic technologies to the study of liver function and disease // Hepatology. —2006. —Vol. 44(2). —P. 299–318.
24. Rosenblatt K.P., Bryant-Greenwood P., Killian J.K. et al. Serum proteomics in cancer diagnosis and management // Ann. Rev. Med. —2004. —Vol. 55. —P. 97–103.
25. Rose K., Bongeleret L., Banssant T. et al. Industrial-scale proteomics: From leters of plasma to chemically synthesized proteins // Proteomics. —2004. —Vol. 4. —P. 2125–2132.
26. Spahr C.S., Davis M.T., Mc Ginley M.D. et al. Towards defining the urinary proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry I. Profiling an unfractionated tryptic digest // Proteomics. —2001. —Vol. 1. —P. 93–97.
27. Ghafouri B., Tagesson C., Lindal M. Proteomics profiling of epidermal mucus secretion of a cichlid (Symphysodon aequifasciata) demonstrating parenteral care behavior // Proteomics. —2003. —Vol. 3. —P. 1003–1006.
28. Joo W.A., Lece D.Y., Kim C.W. The potential of proteomics and peptidomics for allergy and asthma researed // Biosci. Biotechnol. Biochem. —2003. —Vol. 67. —P. 1574–1580.
29. Van Ommen B. Nutrigenomics: exploiting systems biology in the nutrition and health arenas // Nutrition. —2004. —Vol. 20. —P. 4–12.
30. Matthews D. E., Bier D.M. Stable isotope methods for nutritional investigation // Annu. Rev. Nutr. —1983. —Vol. 3. —P. 309–318.
31. Grunenfelder B., Rummel G., Vohradsky J. et. All. Proteomics analysis of the bacterial cell cycle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —2001. —Vol. 98. —P. 4681–4687.
32. Everley P.A., Krijgsveld J., Zetter B.R. et al. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acid in cell culture (SILAC) as a tool for prostatecancer research // Mol. Cell. Proteomics. —2004. —Vol. 3. —P. 729–734.
33. Young V.R. Trace element biology: the knowledge base and its application for the nutrion of individuals and populations // J. Nutr. —2003. —Vol. 133. —P. 1581–1587.
34. Kussmann M., Affolter M., Fay L., Proteomics in nutrition and health // Combinatorial Chem.&High. Throng. Screening. —2005. —Vol. 8. —P. 679–696.
35. Simo C., Barbas C., Cifuentes A. Capillari electrophoresis —mass spectrometry in food analysis // Electrophoresis. —2005. —Vol. 26. —P. 1306—1318.
36. Soga T., Kakazn Y., Robert M. et al. Qualitative and quantitative analysis of amino acids by capillary electrophoresis electrospray ionization tandem mass spectrometry // Electrophoresis. —2004. —Vol. 25. —P. 1964–1972.
37. Soga T., Heiger D.N. Amino Acid Analysis by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry // Anal. Chem. —2000. —Vol. 72. —P. 1236–1241.
38. Klampfl C.W., Ahrz W. Determination of free amino acids in infant food by capillary zone electrophoresis with mass spectrometric detection. // Electrophoresis. —2001. —Vol. 22. —P. 1579—1584.
39. Schultz C.L., Maini M. Method development for amino acid analysis. // Anal. Chem. —2003. —Vol. 75. —P. 1508–1513.
40. Simo C., Rizzi A., Barbas C. et al. Chiral capillary electrophoresis — mass spectrometry of amino acids in foods. // Electrophoresis. —2005. —Vol. 26. —P. 1432–1441.
41. Simo C., Elvira C., Ganzales N. Capillary electrophoresis —mass spectrometry of basic proteins using a new physically adsorbed polymer coating: Some applications in food analysis. // Electrophoresis. —2004. —Vol. 25. —P. 2056–2064.
42. Klampfl C.W., Buchberger W. Determination of carbohydrates by capillary electrophoresis with electrospray-mass spectrometric detection. // Electrophoresis. —2001. —Vol. 22. —P. 2737–2742.
43. Que A.H., Novotny M.V. Separation of Neutral Saccharide Mixtures with Hydrophilic-phase Capillary Electrochromatography using Monolithic Columns // Anal. Chem. —2002. —Vol. 74. —P. 5184–5191.
44. Que A.H., Mechref Y., Huang Y, et al. Coupling Capillary Electrochromatography with Fourier-Transform Mass Spectrometry in Characterizing Complex // Anal. Chem. —2003. —Vol. 75. —P. 1684–1690.
45. Залесский В.Н., Великая Н.В. Антиапоптические, проапоптические и антитоксические реакции молекул флавоноидов — растительных фенолов // Проблеми харчування. —2003. —№1. —С. 38–41.
46. Aramendia M.A., Boran V., Garcia I. et al.. CE-ESI-MS analysis mycsture of the izoflavones // J. Mass Spectrom. Rapid. Com. Mass Spectrum. —1995. —Vol. 16.(suppl.). —P. 153–157.
47. Huck C.W., Stecher G., Ahrer W. et al. Analysis of Three Flavonoids by CE-UV and CE-ESI-MS. Determination of Naringenin from a Phitomedicine // J. Sep. Sci. —2002. —Vol. 25. —P. 904–908.
48. Vanhoenacker G., De Villirs A., Lazon K. et al. Comparison of high —performance liquid chromatography-mass spectroscopy and capillary electrophoresis-mass spectroscopy for the analysis of phenolic compounds in red wines // J. Chromatographia. —2001. —Vol. 54. —P. 309–315.
49. Buzy A., Thibault P., Laycoock M.V. Cappilary electrophoresis of venoms and toxins // J. Chromatogr. —1994. —Vol. 688. —P. 301—316.
50. Pleasance S., Thibault P., Kelly J. Comparison of liquid-junction and coaxial interfaces for capillary electrophoresis-mass spectrometry with application to compounds of concern to the aquaculture industry // J. Chromatogr. —1992. —Vol. 591. —P. 325–339.
51. Zhao J.-Y., Thibault P., Tazawa T. et al. Analysis of tetramine in sea snails by capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. —1997. —Vol. 781. —P. 555–564.
52.  Zhao Y., Schefault M., Sandra P., Banks F. Hyphenation and Detection Sistem. capillary electrophoresis and capillary electrophoresis-electrospray-mass spectroscopy for the analysis of heterocyclic amines // Electrophoresis. —1998. —Vol. 19. —P. 2213–2219.
53. Sentellas S. Moyano P.L., Galceran M. Determination of heterocyclic aromatic amines by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry using in-line preconcentration // Electrophoresis. —1998. —Vol. 24. —P. 3075–3082.
54. Viberg P., Nilsson S., Skod K. In-capillary micro solid-phase extraction and capillary electrophoresis separation of heterocyclic aromatic mass spectrometric detection // Ann. Bioanal. Chem. —2004. —Vol. 378. —P. 1729–1734.
55. Wicherley D., Rose M.E., Giles K. et al. Capillary electrophoresis with detection by inverse capillary electrophoresis spectroscopy and electrospray mass spectrometry for the examination of quaternary ammonium herbicides // J. Chromatogr. —1996. —Vol. 734. —P. 339–348.
56. Nunez O., Moyano E., Galceran M.T. Capillary electrophoresis-mass spectrometry for the analysis of quaternary ammonium herbicides // J. Chromatogr.A. —2002. —Vol. 974. —P. 243–255.
57. Von Brocke A., Wistuba D. et al. On-line coupling of packed capillary electrochromatography with coordination con spray-mass spectrometry for the separation of enantiomers // Electrophoresis. —2002. —Vol. 23. —P. 2963—2972.
58. Isolanzi E., Walker W.A. (Eds.). Allergic Diseases And The Envizonment. (Nestle Nutrition Workshop Series). —Vevey: Karger AG L td, 2004. —P. 27.
59. Akdis C.A., Blasez K., Akdis M. Genes of tolerance. // Allergy. —2004. —Vol. 59. —P. 897–903.
60. Akdis C.A., Joss A., Akdis M. et al. Mechanism of IL-10-Induced T Cell Inactivation in Allergic Inflammation and Normal Response to Allergens // Allergy & Immunol. —2001. —Vol. 124. —P. 180–187.
61. Sabroe I., Parker L.C., Wilson A.G. et al. Toll-like receptors: their role in allergy and non-allergic inflammatory disease // Clin. Exp. Allergy. —2002. —Vol. 32. —P. 984–991.
62. Djukanovic R. The role of co-stimulation in airway inflammation // Clin. Exp. Allergy. —2000. —Vol. 30(suppl.). —P. 46–51.
63. Illig T., Wjst M. Genetics of asthma and related phenotypes // Pediatr. Resp. Rev. —2002. —Vol. 3. —P. 47—53.
64. Beyer K., Grishina G., Bardina L. Identification of an 11s globulin as a major hazelnut food allergen in hazelnut-indused systemic reactions // J. Allergy Clin. Immunol. —2002. —Vol. 110. —P. 517–523.
65. Beyer K., Grishina G., Bardina L. at el Identification of sesame seed allergens by 2-dimensienal proteomics and Edman sequencing seed storage proteins as common food allergens // J. Allergy Clin. Immunol. —2002. —Vol. 110. —P. 154–161.
66. Yu C.J., Chiang B.L., Lin Y. F. at al Tyrosine phosphorylation of I-kB kinase a/b by protein kinase C-dependent c-Src activation Is involved in TNF-a-Induced cyclooxygenase-z expression // J. Immunol. —2003. —Vol. 170. —P. 445—451.
67. Eigenmann P.A. Food allergy: a longway to safe processed foods // Allergy. —2001. —Vol. 56. —P. 1112–1120.
68. Terheggen-Hagro S.W., Khown I.M.,Schaafsma A. et al Safety of a new extensevely hydrolysed formula in children with caw's milk cressover stubly // BMC. Pediatr. —2002. —Vol. 2. —P. 10—17.
69. Alomirah H.F., Alli I., Konishi Y. Aplications of mass spectrometry to food proteins and peptides // J. Chromatogr. —2000. —Vol. 893. —P. 1–12.
70. Yamada H., Murakami K., Wallingford J.C. et al. Identification of low-abundance proteins of bovine colostral and mature milk using two-dimensional electrophoresis followed by microsequencing and MS // Electrophoresis. —2002. —Vol.23. —P. 1153–1157.
71. Bratter P., Blasco I.N., Negretti b. et al. Spexation as an analytical aid in trace element research in infant nutrition // Analyst. —1998. —Vol.123. —P. 821–827.
72. Charlwood J., Hanrahan S., Tyldesley R. et al. Use of proteomic methodology for disease for characterizaction by human milk — globular membrane proteins // Anal.Biochem. —2002. —Vol. 301. —P. 314–319.
73. Mather I.H. A review and proposed nomenclature for major proteins of the milk-fat globule membrane // J. Dairy Sci. —2000. —Vol. 83. —P. 203–207.
74. Cummings C.A., Relman D.A. Using DNA microarrays to stady host-microbe interactions // Emag. Infect. Dis. —2000. —Vol. 6. —P. 513–517.
75. Fuller R. Probiotics in man and animals // Appl.Bacteriol. —1989. —Vol. 66. —P. 365–371.
76. Isolauri E., Kirjavainen P. V., Salminen S. Probiotics: role in the treatment of intestinal infection and inflammation // Gut. —2002. —Vol. 50(supple.3). —P. 154–159.
77. VanderHoof J.A., Young R.J. Food antibody assessment // Allergy Asthma Immunnol. —2003. —Vol. 90. —P. 99–103.
78. Blum S., Schiffrin E.J. Intestinal microflora and homeostasis of the mucosal immune response: implications for probiotic bacteria // Curr. Issues Microbiol. —2003. —Vol. 4. —P. 53–59.
79. Bjorksten B., Nacker P., Sepp E. et al. The intestinal microflora in allergic Estonia and Swedish 2-year-old children // Clin. Exp. Allergy. —1999. —Vol.4. —P. 53–59.
80. Shida K., Makino K., Morishita A. et al. Lactobacillus casei in hibits antigen-induced IgE secretion thronghregulation of cytokine production in splenocyte culture // Int. Arch. Allergy Immunnol. —1998. —Vol. 115. —P. 278–283.
81. Sudo N., Sawamura S., Tahaka K.et al. Probiotics in primary prevention of atopic skin diseases // J. Immunnal. —1997. —Vol. 159. —P. 1739–1741.
82. Hooper L.V., Wong M.H., Thelin A. et al. Molecular analysis of commensal host-microbial regulation in the intestine // Science. —2001. —Vol. 291. —P. 881–884.
83. Fenselan C., Demirev P.A., Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectrom. Rev. —2001. —Vol. 20. —P. 157–163.
84. Dalluge J.J., Fresenius J. Mass Spectrometry for detection of proteins in cells: applications in biotechnology and microbiology // Anal. Chem. —2000. —Vol. 366. —P. 701–707.
85. Claydon M. A., Davay S.N., Edwards J.V. et al. The rapid identification of intact microorganisms using MS // Nat. Biotechnol. —1996. —Vol. 14. —P. 1584–1591.
86. Marvin-Guy L.F., Parche S., Wagniere S. et al. Rapid idenfication of stress-related fingerprint from whole bacterial cells of bifidobacterium lactis using MALDI To-MS // J. Am. Sol. Mass. Spectrum. —2004. —Vol. 15. —P. 1222–1227.
87. Arridsson E., Vignerie N., Andersson I. et al. Effects of different hypocaloric diet on protein secretion from adipose tissue of abuse women // Diabetes. —2004. —Vol. 53. —P. 1966–1969.