УДК 616:36-006-0.91.8:612.396:112+577.15.152

ДОБІР ГІСТОХІМІЧНИХ МАРКЕРІВ ПЕРЕДПУХЛИННИХ ПОШКОДЖЕНЬ ПЕЧІНКИ БІЛИХ НЕЛІНІЙНИХ ЩУРІВ

В.С. Лісовська, Н.М. Недопитанська, к.б.н., О.В. Решавська

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, м.Київ

Суттєве порушення метаболічних процесів у клітинах, що відбувається при канцерогенезі та розвитку пухлин, проявляється в змінах активності та ізоензимного складу багатьох ферментів. Відомо, що виникнення пухлин чи то з низькодиференційованих чи з дедиференційованих клітин базується на однакових фактах появи в пухлинних клітинах ембріональних білків, в тому числі ізоферментів, та дефіциті тканиноспецифічних білків, в тому числі ферментів. Ці зміни використовують під час добору маркерів передпухлинних клітин [1].

На сьогодні таких маркерів відомо кілька десятків. Їх пошук відбувався головним чином на моделях гепатоканцерогенезу, як на зручних, швидко й досить легко відтворюваних моделях, що дають стабільні результати. Один з перших випадків виникнення хімічноіндукованої пухлини печінки в експерименті вдалось отримати Т. Sasaki та Т. Yoshida, які ще в 1935 р. описали гістопатологію гіперплазії, аденоми і карциноми печінки щурів під впливом о-аміноазотолуолу [2], що можна вважати початком розвитку експериментальних моделей гепатоканцерогенезу.

З сучасних моделей для практичного використання більш придатною на наш погляд є модель, що запропонована N. Ito з співавторами [3]. Модель апробована авторами на 170 хімічних сполуках: 90 % мутагенних і немутагенних канцерогенів печінки дали позитивні результати; хибно-негативні результати отримані на гепатоканцерогенах-проліфераторах пероксисом. Навіть з негепатоканцерогенів у даному тесті спрацювало 22 % сполук. В якості маркерів пренеопластичних популяцій гепатоцитів автори використовували виявлення активності гамма-глютамілтранспептидази (гамма-ГТП) та імуногістохімічне виявлення плацентарної форми глутатіон-S -трансферази.

На користь такого вибору свідчить те, що гамма-ГТП та глутатіон-S-трансфераза розглядаються як раково-ембріональні ферменти. Їх активність значно підвищена в тканинах ембріону та гепатомах порівняно з дефінітивною печінкою. Існують дані, що збільшення активності гамма-ГТП відбувається при неопластичних перетвореннях багатьох тканин у тварин і людини. Наприклад, висока активність гамма-ГТП спостерігалась у випадках експериментально індукованих пухлинах шкіри ховрахів; на стадії малігнізації папілом шкіри у мишей; в гепатомах та пренеопластичних змінах щитовидної залози щурів. У людини високий вміст гамма-ГТП знаходили в пухлинах різноманітної локалізації, наприклад, гепатоцелюлярній карциномі, семіномі, пухлинах слизової оболонки рота. При цьому спостерігається вихід гамма-ГТП у плазму крові, що використовується в якості тесту під час діагностики пухлин [1, 4–8].

Серед інших гістохімічних маркерів найчастіше пропонується використовувати дефіцит активності глюкозо-6-фосфатази (Г6Фаза) та зміни активності лактатдегідрогенази (ЛДГ), оскільки однією з загальних характеристик багатьох пухлин є інтинсивний гліколіз та значне уповільнення процесів катаболізму. На феномені втрати пухлинами тканиноспецифічних ферментів грунтується підхід щодо виявлення дефіциту активності аденозинтрифосфатази (АТФаза), Г6Фази тощо. Трансформовані гепатоцити недостатньо накопичують залізо, але надмірно накопичують глікоген, що також застосовується для їх гістохімічної ідентифікації [1, 4, 5, 9].

Всі маркери переднеопластичних пошкоджень встановлені на моделях з використанням лінійних тварин (Fisher 344, Sprague-Dawley, Wistar, Lewis та ін.). Задачею даної роботи було з`ясуваня можливості використання цих маркерів в дослідженнях канцерогенних властивостей хімічних сполук на генетично гетерогенній популяції тварин.

Матеріали та методи дослідження

Досліди проведені на 30 нелінійних білих щурах-самцях вагою 200 г та віком 2 місяці з розплідника "Глеваха" НАН України, розподілених на 3 групи порівну. Відпрацювання гістохімічних маркерів пренеопластичних пошкоджень гепатоцитів проводили на моделі "NDEA-гепатектомія" за схемою N. Ito et al. [3]. Гепатоцити ініціювали ін`єкцією N-нітрозодиетиламіну (NDEA) на фоні часткової гепатектомії.

Щурам 1-ої групи NDEA вводили одноразово інтраперитоніально в дозі 200 мг/кг. Через 24 години після ін`єкції проводили під ефірним наркозом часткову гепатектомію: лівої бічної та центральної часток.

Тварини 2-ої групи підлягали лише гепатектомії. Тварини 3-ої групи не зазнавали ніяких впливів і використовувались в якості інтактного контролю.

Через вісім тижнів після початку експерименту проводили розтин піддослідних та контрольних щурів. При цьому вилучали зразок тканини печінки розміром 1 см³ і готували кріостатні зрізи товщиною 15 мкм. Для реакції на гамма-ГТП зрізи фіксували у холодному ацетоні. Виявлення активності ЛДГ, АТФази та Г6Фази проводили на зрізах нативної тканини. Накопичення заліза виявляли на парафінових зрізах фіксованої у 10 %-му розчині забуференого формаліну тканині печінки.

Умови проведення гістохімічних реакцій були максимально стандартизовані: зрізи печінки тварин різних груп розташовували рядами на одне скло таким чином, що на першому склі були подані зрізи печінки всіх тварин під № 1 кожної групи, на другому склі — всіх під № 2 і так далі. Це дозволяло запобігти мінімальним варіаціям таких параметрів, як тривалість інкубації та температура інкубаційного середовища.

Реакцію виявлення гамма-ГТП проводили методом азосполучення по [10], в якості субстрату використовували гамма-L-глутаміл-1-нафтиламід з додаванням у інкубаційне середовище активатору гліцилгліцину.

Реакцію виявлення АТФази проводили свинцевим методом Wachstein-Меisel, в якому замість сульфіду амонію використовували сульфід натрію (Na₂S) для забарвлення нерозчинного осаду субстрату з свинцем [11].

Реакцію виявлення активності Г6Фази проводили методом з використанням солей важких металів по Wachstein-Меisel в модифікації Лойда та співавт. [10], інкубаційне середовище готували на розчині D-глюкозо-6-фосфату натрію, для забарвлення нерозчинного осаду субстрату з свинцем також використовували сульфід натрію (Na₂S).

Реакцію виявлення залізодефіцитних вузликів проводили за методом [12].

Реакцію виявлення активності ЛДГ проводили тетразолієвим методом по [10] в гелєвому інкубаційному середовищі для запобігання вимивання ферменту. Показниками ініціації гепатоцитів є наявність, кількість та розміри гіперпластичних вузликів. Вимірювання частоти та площини вузликів проведені двома способами: на цитоаналізаторі "Інтеграл-2МТ" та на комп`ютері за допомогою пакету поліграфічних програм для обробки кольорового зображення "TIFF".

Цитоаналізатор дає змогу вивести мікроскопічне зображення зрізу на дисплей, окреслити ферментно-активні вузлики та виміряти їх площу.

В комп'ютер зображення зрізу печінки з гіперпластичними вузликами вводили за допомогою сканеру. Знімали фонове забарвлення, залишаючи тільки гіперпластичні вузлики. Програми вищезгаданого пакету дозволяють отримувати площину всього зображення та площину фону. Різниця між ними й становить площину вузликів. На кожен малюнок виміряної площини підраховували кількість вузликів.

Кількісні показники — частота зустрічаємості та площина вузликів оброблені з використанням t-критерію Ст`юдента.

Результати та їх обговорення

Ензимомаркерне виявлення пренеопластичних гепатоцитів грунтується на тому факті, що ініційовані клітини не містять будь-яких ферментів, які б не зустрічались у нормальних клітинах на різних етапах їх диференціювання, ускладнюючи виявлення трансформованих під час канцерогенезу клітин. Але не зважаючи на це, ензимомаркерний аналіз, в основі якого лежить зміна активності ферментів, залишається одним з основних методів фенотипичної ідентифікації пренеопластичних та трансформованих клітин. В літературі описані зміни активності та зміни ізоензимного складу ЛДГ для різних неопластичних процесів [1], але головна тенденція — зростання активності, що дозволяє використовувати тест на даний фермент при діагностиці та спостереженнях за ходом лікування онкологічних хворих.

ЛДГ (L-лактат: NAD⁺ оксидоредуктаза) діє на останньому етапі гліколізу, що відбувається в анаеробних умовах та супроводжується відновленням пірувату до L-лактату. Більша частина ферменту не міцно зв`язана з клітинними структурами, зустрічається в цитоплазматичному матриксі, менша частина міцно прикріплена до мембран мітохондрій [10].

Активність ЛДГ в наших дослідах проявлялась у вигляді мозаїчно-забарвлених формазаном локусів тканини печінки. Зокрема активність ферменту була підвищена в клітинах на периферії часток, та особливо в гепатоцитах, що оточують центральну вену (рис.1), в інших ділянках — навпаки (рис.2). Така мозаїчна активність спостерігалась як у щурів, що підлягали одноразовій ін`єкції NDEA з послідуючою гепатектомією (1 група), так і у щурів, яким робили лише гепатектомію (2 група). В даному випадку наявність підвищеної активності ЛДГ не може бути наслідком процесу регенерації, оскільки через два місяці після операції процесс відновлення тканини печінки щурів повністю завершується. Різниці між групами в інтенсивності забарвлення та в топографічному характері реакції ми не спостерігали. Не знайдено також структурно оформлених часточок печінки, які б виявлялись за допомогою чи то збільшення, чи навпаки, дефіцитом зерен формазану, що свідчило б про зниження активності ЛДГ в них. Теж саме спостерігали у інтактних тварин (3 група).

Рисунок 1. Активність лактатдегідрогенази в печінці щура, підвищена переважно в гепатоцитах по періферії часток. Метод Lojda х 100

Таким чином, відсутність різниці в характері реакції на активність ЛДГ може свідчити про те, що в нашому досліді ми спостерігали гістохімічні особливості, характерні для тканини печінки, трансформовані гепатоцити виявити не вдалося.

Можливо, це пояснюється тим, що суттєві зміни активності ЛДГ більш характерні для злоякісних пухлин, тоді як у пренеопластичних гепатоцитах та клітинах гепатом спостерігаються зміни ізоензимного складу ферменту (збільшення вмісту Н-форм ЛДГ) в бік набуття подібності з ембріональною печінкою [1, 13, 14]. Таким чином, ми дійшли висновку, що виявлення активності ЛДГ у якості маркеру переднеопластичних пошкоджень потребує подальших досліджень, спрямованих на визначення ізомерних форм, а для прикладних цілей зручніші більш специфічні маркери.

Рисунок 2. Активність лактатдегідрогенази в печінці щура, підвищена переважно в центролобулярних гепатоцитах. Метод Lojda х 200

На відміну від ЛДГ, активність Г6Фази, в неопластичних клітинах найчастіше зменшена і, в цілому, знижується пропорційно швидкості їх росту [1, 4]. На цьому грунтується визначення гіперпластичних вузликів в печінці як Г6Фазадифіцитних.

Г6Фаза гідролізує D-глюкозо-6-фосфат та контролює перенесення фосфатних груп різноманітних нуклеозидди- та трифосфатів на глюкозу. Г6Фаза виявляється переважно в клітинах, що виробляють глюкозу та транспортують її в кров. Фермент пов`язаний з ендоплазматичним ретикулумом гепатоцитів, тому може слугувати маркером ендоплазматичного ретикулума. В нормальній печінці більш висока активність Г6Фази спостерігається в клітинах перипортальної зони, у так званих глюкозоутворюючих гепатоцитах.

Ми виявляли активність Г6Фази на кріостатних нефіксованих зрізах печінки. Проте було виявлено досить низьку активність ферменту в ділянках паренхіматозних клітин у вигляді грубої зернистості коричнево-чорного кольору (рис.3). Розташування скупчень забарвлених клітин не мало структури і чітких меж і визначити вузлики, позбавлені ферментної активності при такій невиразній топографії реакції було дуже складно. Різниця в інтенсивності реакції у тварин в межах однієї групи робила неможливою встановити її між різними групами. Ми очікували виявити активність Г6Фази переважно в перипортальних зонах і досить дифузно в інших гепатоцитах, на фоні яких чітко виділялися б локуси зниженої активності. Однак отримана картина не давала можливості ідентифікувати пренеопластичні гепатоцити.

Рисунок 3. Активність глюкозо-6-фосфатази в тканині печінки. Відсутність чітких меж ферментно-дефіцитних ділянок тканини. Метод Wachstein-Меisel х 200

І.А. Ходосова, 1988 [1] в експерименті біохімічними методами отримала найбільше пониження активності Г6Фази через 4–11 діб після впливу канцерогену, через 24 доби активність нормалізувалась. В нашому досліді ми знімали показники набагато пізніше — через 60 діб, що частково пояснює відсутність розбіжностей між групами. Але саме в цей термін з`являються гіперпластичні вузлики, що повинні мати дефіцит активності Г6Фази. Деякі автори [4], навпаки, наголошують на тому, що помітне зниження активності Г6Фази відмічається в пізніші строки гепатоканцерогенезу, через 6–8 тижнів після впливу канцерогена. Посилаючись на аналіз робіт інших авторів, вони зазначають необхідність використання Г6Фази в комплексних дослідженнях поруч з іншими гістохімічними маркерами.

Таким чином, отримана нами нечітка картина Г6Фазодефіцитних локусів печінки пов`язана, з одного боку, можливо, з невдало вибраним строком виявлення цієї фенотипічної ознаки перетворених гепатоцитів, оскільки не виключена можливість того, що для нелінійних щурів оптимальний строк виявлення дефіциту ферменту знаходиться за межами 8 тиж; з іншого боку, не можна виключити артефакти, характерні для всіх реакцій з використанням солей металів. Враховуючи зазначене, можна зробити висновок про недостатність отриманих результатів для судження про специфічність Г6Фази в якості маркеру для нелінійних тварин, але ясно, що застосовувати його краще як допоміжний в комплексі з іншими.

АТФаза (аденілпірофосфатаза) гідролізує ATФ і є маркерним ферментом щодо плазматичних мембран. У нормальній печінці висока активність АТФази виявляється у жовчних капілярах перипортальних зон і значно слабкіша — у центральних ділянках часточок. У цитоплазмі гепатоцитів визначається слабка активність мітохондріальної АТФази [4,10]. Згідно даним літератури [4] саме дифіцит активності АТФази жовчних капілярів та цитоплазми клітин є фенотипічною ознакою для ідентифікації гіперпластичних вузликів печінки.

Активність ферменту на зрізах печінки в наших дослідах досить чітко виявлялась в жовчних канальцях та венозних стінках (рис.4). Така локалізація характерна для плазматичної АТФази. Активність мітохондріальної (гомогенної) АТФази гепатоцитів була значно нижча й практично не диференціювалась від фонового забарвлення. У тварин 1-ої групи ми знаходили достатньо великі ділянки зі зниженою активністю АТФази в клітинах жовчних канальців, межі яких були не чіткі. В цих же ділянках забарвлення цитоплазми гепатоцитів також візуально було слабкішим. Отримані не зовсім чіткі локуси дефіциту активності АТФази, скоріш за все, можна було б зробити контрастнішими шляхом легкого пошкодження мітохондрій, наприклад, заморожуванням та послідуючим відтаюванням гістологічних зрізів. Але тоді слід співставляти результати двох паралельних реакцій на обов`язково почергових зрізах, що технічно ускладнює процедуру як самого виявлення активності, так і статистичної обробки диних.

Рисунок 4. Активність АТФази в жовчних канальцях та венозних стінках тканини печінки. Метод Wachstein-Меisel х 200

Слід зазначити, що схожі ферментно-дефіцитні локуси, хоча і поодинокі, спостерігались і у тварин інших груп (2 і навіть 3 групи). Крім цього, були відмічені артефактні зони надлишкового забарвлення, де структура тканини зовсім не проглядалась. Це можна віднести до вже згадуваних вад методів з солями металів. Аналіз отриманих результатів не дає можливості однозначно висловлюватись з приводу використання АТФази в якості маркеру передпухлинних пошкоджень печінки у нелінійних щурів, але як і Г6Фаза, в комплексі з іншими він цілком прийнятний.

До гістохімічного маркеру ранніх пренеопластичних перетворень гепатоцитів відносять також недостатнє накопичення в них заліза. Так, у [4] проведено аналіз даних літератури, згідно яких, залізодефіцитні вузлики виявляються дійсно частіше за інші. Завдяки дослідженням на серійних зрізах печінки підраховано, що на  см² зрізу налічується 42 залізодефіцитних вузлика, 33 — гамма-глютамілтранспепти-дазапозитивних, 28 — АТФазадефіцитних та 20 — Г6Фазадефіцитних.

В наших дослідах, проведених на парафінових зрізах фіксованої у формаліні тканини печінки, залізо визначалось лише в ділянках, що оточують великі судини (рис.5), в паренхімі органу реакція практично не відбувалась, що унеможливлювало ідентифікацію залізодефіцитних локусів. Цей фрагмент роботи потребує подальших досліджень.

Рисунок 5. Реакція на залізо в печінці за методом Perls х 200

Серед апробованих нами ферментів був раково-ембріональний — гамма-ГТП. Відомо, що активність гамма-ГТП відсутня в диференційованих гепатоцитах. Поява її активності в клітинах печінки характерна для трансформованих клітин. Гамма-ГТП (гамма-глютамилтрансфераза, гамма-L-глютамилпептид:амінокислота-гамма-глютамилтрансфераза) каталізує перенесеня гамма-L-глютамілових радикалів гамма-L-глютамілпептидів на різні амінокислоти та пептиди, в результаті чого утворюються гамма-L-глютамілпептиди. [10].

Як і очікувалось, активність гамма-ГТП в наших дослідах чітко з`явилась в тканині печінки тварин 1 і 2 груп та була відсутня у інтактного контролю, хоча в контрольному зрізі нирки активність відмічена. Активність ферменту визначалась в популяції гепатоцитів, що тяжіють до перипортальних зон (рис.6).

Рисунок 6. Гамма-глютамилтранспептидазні пренеопластичні гепатоцелюлярні вузлики. Метод Lojda х 400

З усіх тварин 1 групи гамма-ГТП-позитивні вузлики знайдено у 80 % тварин, у стількох же з 2 групи, але в 3-х з них вузлики були чіткі й за розміром і за забарвленням, а в інших це були швидше групи гамма-ГТП-позитивних клітин. На відміну від інших гістохімічних реакцій, саме гамма-ГТП-позитивні вузлики можна було поміряти та підрахувати. Розміри (площина у мм²) виявлених вузликів та їх кількість на 1 см² як за допомогою пакету поліграфічних програм на комп`ютері, так і на цитоаналізаторі "Інтеграл-2МТ", представлені в таблиці.

Різні способи вимірювань дещо впливають на значення показників, це може бути пояснено більшою похибкою методу вимірювань на цитоаналізаторі, який включає ручне окреслення гіперпластичного вузлика та вилучення з вимірювань на розсуд експериментатора невеликих скупчень ферментно-позитивних клітин. При цих вимірюваннях похибка середнього також значно більша.

Слід наголосити на тому, що значення, отримані різними способами вимірювання, є одного порядку та зберігають основну тенденцію: у тварин 1-ої групи кількість та розміри гіперпластичних вузликів більші, ніж у щурів 2-ої групи при їх відсутності в контролі. Тому, виходячи з вищесказаного, можна зробити висновок про доцільність використання комп`ютеру в подібних експериментах.

Дані таблиці демонструють, що на 1 см² площі зрізу печінки нелінійних білих щурів через 2 місяці після ініціюючих впливів з`являється 10–20 гіперпластичних вузликів площею 0,2–0,4 мм². Порівняння наших результатів з даними N. Ito et. al. [3], який проаналізував відмінності в площині гіперпластичих вузликів, виявленних імуногістохімічно за допомогою маркеру глутатіон-S-трансферази у щурів восьми різних ліній саме через 8 тижнів експерименту, показує дуже близькі результати — на лініях Fisher 344 (0,37±0,13 мм²) та Wistar (0,38±0,13 мм²).

Що стосується терміну проведення реакції ідентифікації гіперпластичних вузликів, то як вже зазначено вище, ми обрали схему [3], згідно якої цей термін дорівнює 8 тижням. Такий строк найпридатніший тому, що до цього часу клітини "регенераційних" проліфератів вже диференційовані і набувають фенотипічних ознак нормальних зрілих гепатоцитів, а вузлики, які виявляли за допомогою маркерів є пренеопластичними. Їх кількість на 1 см² неоднакова: від поодиноких вузликів до кількох десятків. Цікавий той факт, що в дослідах [3] у лінійних щурів при ініціації NDEA в дозі 200 мг/кг після часткової гепатектомії, через 4 тижні вузлики з`являються в кількості 24,71±12,90 на 1 см². В наших же дослідженнях, було отримано практично такий же результат (21,8±3,2 на 1 см²), але через 8 тижнів. Можливо, це пов'язано із зниженою динамікою розвитку переднеопластичних перетворень у нелінійних тварин, за рахунок більшого імунологічного пресу в порівнянні з лінійними тваринами і, відповідно, вищої життєздатності гетерогенної популяції. Що стосується площини вузликів, ці дані також досить різноманітні. Наприклад, в вище згаданій роботі площина вузликів в одному експерименті значно перевищувала отриману нами (5,68±2,29 мм² проти 0,366±0,032 мм² відповідно), хоча в іншому експерименті практично не відрізнялась (0,37±0,13 мм²). Зрозуміло, що ці параментри залежать від великої кількості чинників, насамперед, терміну досліджень, обраного маркеру пренеопластичних пошкоджень, лінії тварин, ініціюючих впливів та т.і.

Аналіз отриманих результатів та порівняння їх з даними літератури дозволяють вважати, що:
– зміни активності лактатдегідрогенази не дозволяють чітко ідентифікувати трансформовані клітини в умовах проведених дослідів. Подальші дослідження мають бути спрямовані на визначення ізомерних форм ЛДГ.
– зниження активності Г6Фази, АТФази можуть бути рекомендовані для виявлення гіперпластичних вузликів печинки в комплексних дослідженнях поряд з іншими маркерами. Їх застосування в якості самостійних маркерів обмежується досить низькою частотою їх виявлення та пов`язаною з цим можливістю отримання хибнонегативних результатів.
– найпридатнішим гістохімічним маркером переднеопластичних пошкоджень печінки нелінійних щурів є фермент гамма-ГТП.

Література
1. Ходосова И.А. Ферменты опухолевых клеток. 1988. —Л: "Наука". —176с.
2. Sasaki T., Yoshida T. Experimentelle Erzeugung des Lebercarcinoms durch Futterung mit o-Aminoazotoluol// Virchows Arch. Pathol. Anat. —1935, N 295. —P. 175–200.
3. Ito N., Shirai T., Hasegawa R. Medium-term bioassays for carcinogens//Mechanism of carcinogenesis in risk identification/ Ed. Vainio H., Magee P.N., McGregor D.B., Mc Michael A.J. —1992, N 116. —Lyon: International Agency for Research on Cancer. —Р. 353–388.
4. Винарчук М.П., Быкорез А.И. Ранние гистохимические маркеры гепатоканцерогенеза // Эксперим. онкология. —1984. —T. 6, N 1. —С.11–16.
5. Pitot H.C. Altered hepatic foci: Their Role in Murine Hepatocarcinogenesis//Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. —1990, N 30. —P. 465–500.
6. Gamma-Glutamyltransferase Activity in Atyhical Acinar Cell Nodules of Rat Pancreas/Faribault G., Wiebkin P., Hamilton J.W., Longnecker D.S., Curphey T.J.//Toxicol. Appl. Pharmacol. —1987, N 88. —P. 338–345.
7. Hanigan M.H., Piot H.C. Gamma-glutamyl transpeptidase — its role in hepatocarcinogenesis //Carcinogenesis. —1985. —Vol.6, N 2. —P. 165–172.
8. Beer D.G., Pitot H.C. Biological Markers Characterizing the Development of Preneoplastic and Neoplastic Lesions in Rodent Liver//Arch. Toxicol. —1987. —Suppl.10. —P. 68–80.
9. Bannasch P. The multistage evolution of invasive neoplasia //Triangle . —1991. —Vol. 30, N 3/4. —P. 101–111.
10. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. —1982, М.:Мир. —270 с.
11. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. —1982, М.:Медицина. —301 с.
12. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. —1969, М.: Мир. —645 с.
13. Curtin N.J., Snell K. Enzimic retrodifferentiation during hepatocarcinogenesis and liver regeneration in rats in vivo//Brit.J.Cancer. —1983. —Vol.48, N 3. —P. 495–505.
14. Голубев А.М. Изоферменты новообразований. —1981. М.: Наука. —144с.