|
ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ УДК 576.311.1 НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ БИОХИМИИ, ХИМИИ, МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ ЦИТОХРОМА Р-450 (обзор литературы) Н.Я. Головенко, академик АМН Украины Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса Значительным событием в биохимии ферментов можно считать открытие цитохрома Р-450. Немногим более сорока лет тому назад Гарфинкль [1], Клингенберг [2] установили, что эндоплазматическая сеть печени экспериментальных животных содержит неизвестное пигментное вещество, которое, восстанавливаясь, присоединяет окись углерода и образует комплекс с максимумом поглощения при 450 нм. Позже такое соединение было названо Р-450, а когда была определена его гемопротеиновая природа — цитохромом Р-450. Впоследствии оказалось, что цитохром Р-450 является простетической группой ферментов, относящихся к монооксигеназам (гидроксилазам). Они широко распространены в живой природе [3], так как обнаружены в различных таксономических группах (беспозвоночные, позвоночные животные, растения, бактерии). Их локализация у животных не ограничивается печенью, а включает широкий круг органов и тканей. Наиболее удивительным свойством цитохром Р-450 зависимых ферментов является то, что они окисляют большое число природных субстратов и практически все ксенобиотики. Отсюда значительный интерес к этой проблеме возник не только у биохимиков, но также у химиков, молекулярных биологов и генетиков. В биохимии основное внимание уделяется молекулярной организации, каталитическим свойствам и механизму действия ферментов [4]. Химические аспекты связаны с изучением физико-химических свойств субстратов и определением взаимосвязи структура-активность ферментов, а также изысканием модельных систем для установления химических принципов активации молекулярного кислорода, имитирующих монооксигеназы [5]. Нельзя не отметить ключевую роль цитохром Р-450 — зависимых ферментов в фармакологии. Они настолько адаптированы к исследовательской работе фармаколога, что получили свое название "лекарство-метаболизирующие ферменты". Они во многих случаях определяют активность лекарств (пролекарств), их фармакологический профиль, а также побочное действие и толерантность [6, 7]. Особое отношение к этим ферментным системам и в токсикологии [8]. Метаболиты, образующиеся в процессе монооксигеназного катализа, оказывают определяющее влияние на генетические процессы, состояние клеточного деления (репродукция, мутагенез, онкогенез). В связи с кардинальными изменениями воззрений на природу цитохрома Р-450 и особенно молекулярнобиологические и генетические исследования его изоформ, а также исходя из новой классификации, предложенной в последние пять лет, в настоящем сообщении мы попытались проанализировать имеющийся материал и обратить внимание на эту проблему. Биохимия и химия цитохрома Р-450 С биохимической точки зрения цитохром Р-450 — зависимые ферменты катализируют прямую реакцию между своими субстратами и О2. В целом, ферменты, использующие молекулярный кислород для окисления субстратов, широко представлены в живой природе — диоксигеназы, которые присоединяют к субстрату оба атома кислорода; монооксигеназы (цитохром Р-450 — зависимые), присоединяющие один атом кислорода к субстрату и восстанавливающие второй атом до воды; оксидазы, которые восстанавливают молекулу кислорода до перекиси водорода или до двух молекул воды без внедрения кислорода в субстрат. Монооксигеназы, в которых роль простетической группы выполняет цитохром Р-450, в зависимости от места локализации можно разделить на три группы [4]. Между группами ферментов имеются существенные различия, однако все они, как уже указывалось, содержат цитохромы Р-450. Как и другие гемопротеины (гемоглобин, каталаза), цитохром Р-450 имеет тетрапиррольную простетическую группу, содержащую ион железа. Хелатный комплекс протопорфирина с Fe2+ называется гемом или протогемом. Аналогичный комплекс с Fe3+ носит название гемина или гематина. В геме 4 лигандные группы порфирина образуют комплекс с железом, имеющий плоское строение. 5 и 6 координационные связи расположены перпендикулярно к плоскости порфиринового кольца. В гемоглобине 5 положение занято имидазольной группой гистидина, а 6 остается незамещенным, либо замещается кислородом. Природа 5 и 6 лигандов в цитохроме Р-450 окончательно не выяснена. Известно, что системы, где 5 лигандом является атом серы, а 6 — азот имидазола, лучше всего моделируют свойства этого гемопротеина [5]. Следует отметить, что в настоящее время, исходя из неполного соответствия гемопротеина классу цитохромов, Номенклатурной Комиссией Международного Союза биохимиков и Молекулярных биологов (NC-IUBMB) рекомендовано этот фермент называть гем-тиолатный протеин Р-450 вместо цитохром Р-450 [9]. Белковая часть различных изоформ цитохрома Р-450 отличается аминокислотным составом, но все они имеют консервативный участок у концевой карбоксильной группы, содержащий 26 аминокислотных остатков. Несмотря на то, что цитохром Р-450 зависимые ферменты из разнообразных биологических источников отличаются друг от друга, существует определенная последовательность реакций, при которых гемопротеин взаимодействует с субстратами, кислородом и донорами электронов (рисунок). Обычно такое взаимодействие условно можно разделить на 5 отдельных стадий [5]: Число субстратов, вовлекающихся в монооксигеназный катализ, очень большое. Поэтому принято их подразделять на определенные типы реакций (табл. 1). Из химической структуры субстратов и продуктов их окисления (метаболитов) очевидно, что такие реакции могут осуществляется как с эндогенными, так и с чужеродными (ксенобиотиками) соединениями. К первой группе относятся стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, простагландины, лейкотриены, биогенные амины, ретиноиды, гидроперекиси липидов [10,11]. Растения используют цитохром Р-450 — зависимые ферменты для гидроксилирования природных соединений, ответственных за вкус, запах и окраску (пигмент) цветков, которые очень чувствительны к повреждающим факторам [3]. Ко второй группе относятся многие синтетические и природные лекарственные средства, пестициды, гербициды, промышленные яды, отходы промышленных предприятий, пищевые добавки, косметические составы и пр. [3]. С физиологической точки зрения, реакции гидроксилирования ксенобиотиков направлены на защиту живых систем от накопления в них гидрофобных соединений. Однако, во многих случаях эти процессы приводят к образованию промежуточных реакционноспособных активных метаболитов, продуктов неполного восстановления кислорода, которые химически модифицируют макромолекулы и стимулируют реакции перекисного окисления. Все это служит причиной проявления различных видов токсичности, канцерогенеза, мутагенеза, тератогенеза и аллергий. Следовательно, цитохромы Р-450 играют чрезвычайно важную роль в поддержании стационарного уровня эндогенных лигандов, вызывая лигандмодулирующую транскрипцию генов, определяя тем самым рост, дифференциацию, апоптоз, а также клеточный гомеостаз и нейрогуморальную функцию. Исходя из общих принципов биохимии о субстратной специфичности ферментов (абсолютная и относительно широкая) все же трудно предположить даже для второго случая, что каталитическое окисление столь многочисленных по химической структуре субстратов может осуществляться одним цитохром Р-450 зависимым ферментом. Вначале для доказательства существования цитохрома Р-450 в различных изоформах были использованы его индукторы. Количество веществ, вызывающих индукцию монооксигеназ, окисляющих ксенобиотики, превышает несколько сотен [5]. Это различные по химической природе и биологическому действию соединения. Единственным общим свойством для них является то, что они жирорастворимые и в значительных количествах накапливаются в эндоплазматической сети клеток. Такое избирательное поступление веществ в цитомембраны способствует взаимодействию фермента с субстратом. Чем длительнее субстрат находится в организме, тем продолжительнее его контакт с ферментом и, следовательно, более высокий уровень его индукции. Можно предположить, что индукция в своей основе носит приспособительный характер, так как приводит к увеличению скорости метаболизма ксенобиотиков, то есть к ускорению их элиминации из организма. Исследования, проведенные с классическими индукторами (фенобарбитал, 3-метилхолантрен) цитохрома Р-450, а также спектральные характеристики комплексов фермент-субстрат показали, что в одном и том же биологическом объекте этот гемопротеин существует в нескольких разновидностях. Такое заключение приводило к дальнейшим вопросам, касающихся прежде всего количества этих изоферментов и возможности их классификации. Оказалось, что множественные формы цитохрома Р-450 в сравнении с другими ферментами имеют относительно невысокую субстратную специфичность и часто один и тот же субстрат окисляется различными изоформами. К сожалению, отсутствуют и специфические по отношению к тем или иным изоформам цитохрома индукторы или ингибиторы. Все это затрудняло классификацию изоформ цитохрома Р-450. Молекулярная биология и генетика цитохрома Р-450 Бурное развитие в последние время молекулярной биологии и генетики позволило решить некоторые сложные вопросы обсуждаемой проблемы. Исходными критериями послужили общеизвестные биологические закономерности. Прежде всего это касается того, что регуляторные механизмы клетки определяются, в конечном счете, генами и их продуктами. Внутри клетки происходит непрерывная транскрипция многих генов, хотя часть генома может не проявляться. К факторам, определяющим скорость синтеза ферментов на рибосомах в цитоплазме, относятся как скорость транскрипции, так и скорость деградации молекул мРНК. Таким образом, гены контролируют определенные метаболические реакции, регулируя биосинтез ферментов. Это нашло отражение в утверждении "один ген — один фермент". Следовательно, биосинтез различных изоформ цитохрома Р-450 должен находиться под генетическим контролем и они должны отличаться друг от друга только аминокислотной последовательностью. Одни из них могут быть конститутивными, образующиеся независимо от того, в каких условиях находится клетка, другие — индуцибильные, часто синтезирующиеся в следовых количествах и достигающие определенного уровня при наличии эндогенных или экзогенных субстратов. Для некоторых изоформ цитохрома Р-450 наблюдается явление импритинга, заключающееся в том, что после введения в неонатальном периоде индуктора (фенобарбитал) соответствующие значения гемопротеида в печени животных сохраняются и при достижении половой зрелости. В этом случае происходит необратимая индукция этих ферментов [12]. Следует отметить, что для некоторых конститутивных изоформ ферментов также наблюдается явление индукции, а для других оно отсутствует. Поэтому для изоформ цитохрома Р-450 характерной особенностью является экспрессия генов. Транскрипционная активация отдельных генов начинается на различных стадиях развития организмов и зависит от пола, вида животных и типа их тканей [13]. Для транскрипции некоторых генов обнаружен их фенобарбитал — чувствительный промотор, содержащий отрицательные и положительные регулирующие элементы [14]. Им может быть специфический белок, который в фосфорилированной форме действует как положительный элемент промотора, а в дефосфорилированной — как отрицательный. Гормон роста, половые гормоны, глюкокортикоиды и тиреоидные гормоны в значительной степени способны модулировать экспрессию генов [15]. Методами белковой химии (очистка ферментов, определение аминокислотного состава и др.), а также молекулярной биологии (иммунохимические методы) в настоящее время установлено большое количество изоформ цитохрома Р-450, а отсюда и их генов. Количество таких генов составляет в настоящее время около 500. Они обнаружены в 85 видах эукариот (беспозвоночные, позвоночные животные, растения, грибы) и 20 видах прокариот. Учитывая общность происхождения генов и принципы подобия аминокислотного состава белковой молекулы изоформ цитохрома Р-450 было предложено использовать эту закономерность для их классификации. Для обозначения цитохромов Р-450 используют абривиатуру CYP (cytochrom Р-450). Гены и продукты их экспрессии (mRNA, cDNA) также обозначаются CYP. Исключения составляют гены мышей и дрозофил (Cyp). Все цитохромы Р-450 называются суперсемейством, которое подразделяется на семейства. Сюда входят белки, которые имеют около 40 % подобия аминокислотного состава и обозначаются цифрой (1; 2; 3 и т. д.). Подсемейства — белки с аминокислотным подобием 65 %. Для их обозначения используются буквы латинского алфавита (А, В, С и т. д.). Внутри подсемейства белки имеют сходство более чем на 65 % и это, как правило, индивидуальные ферменты (изоформы). Они обозначаются цифрой, стоящей после буквы (1А1; 3В3; 3С4 и т. д.). К настоящему моменту известно около 120 семейств цитохромов Р-450 (табл 2). Такая классификация имеет ряд неудобств и трудностей. Это касается, прежде всего, тривиальных наименований генов, которые были открыты ранее, а позже была установлена их роль в кодировании цитохрома Р-450. Например, для Drosophila melanogaster и Arabidopsis thaliana определен ген Eig17-1, который является не чем иным, как Cyp 18. Следовательно, Cyp становится официальным синонимом. Во многих публикациях использована старая номенклатура гемопротеинов, основанная на видовых особенностях ("olf 1" и "II C16" кодируются соответственно крысиными CYP2Y1 и крольичьими CYP2C16 генами). В банке данных также существует переход от старых наименований монооксигеназ, катализирующих гидроксилирование стероидов, на новую классификацию. Например, Р450sсc, Р45011b1, Р45011b2, Р450arom могут называться Р450sсc, Р450c11b1, Р450cb1, Р450arom, но правильнее, CYP11B1, CYP11B2, CYP17 соответственно. В настоящее время методы молекулярной биологии позволяют осуществлять различные манипуляции генетическими элементами. Они включают внедрение генов клонированием рекомбинантных молекул ДНК, сконструированных in vitro. Образующуюся при этом гибридную молекулу ДНК можно затем клонировать in vivo. Новая методология позволяет выделить индивидуальные фрагменты ДНК (гены) из любого источника в больших количествах. Благодаря таким находкам удалось получить изоформы цитохромов Р-450, отличающиеся аминокислотной последовательностью от природных гемопротеинов. В данном случае рекомендовано использовать следующую номенклатуру. Вначале указывается природная изоформа цитохрома Р-450, затем идет абривиатура X###Y, где X — аминокислотная последовательность в его участке ###, а Y — замена в этом участке одной или более аминокислот на другие в рекоструированном (химерном) гемопротеине. Например, CYP1A1I426V свидетельствует о том, что в CYP1A1 в положении 426 изолейцин заменен валином. Наличие столь разнообразной информации об изоформах цитохрома Р-450 послужило основой для построения филогенетического дерева эволюции этих белков. Известно, что функционально те же самые ферменты из филогенетически удаленных видов сохраняют общие элементы структуры, но могут иметь существенно различающиеся последовательности. Однако существенным для таких белков является то, что они не имеют изменений аминокислотной последовательности в области активного центра. Вероятно, любое изменение на этом участке либо изменяет его стерическое соответствие и способность связывать субстрат, либо приводит к утрате той группы, которая принимает участие в каталитическом процессе. Следовательно, передачу признаков с модификацией можно легко оценить по дивергенции аминокислотной последовательности гомологичных белков, т. е. на основе вычисленного количества мутаций в кодонах. По-видимому, темп мутаций, проявляющийся в аминокислотной последовательности, меняется во времени и различен для разных семейств. Существуют несколько схем, определяющих родство отдельных семейств цитохромов Р-450 [16-18]. В наиболее распространенной и общепризнанной [9] основные семейства или отдельные изоформы разбиты на восемь (I-VIII) групп, которые последовательно связаны друг c другом. Основаны они на гомологиях в полипептидных цепях. К I группе (5 генов) относятся гемопротеины (четыре), присутствующие в организмах позвоночных животных, а CYP18 обнаружен только у насекомых. Группа II представлена кластером генов (13), встречающихся у растений. Группа III (6 генов) характерна для беспозвоночных животных. К группе IV (5 генов) относятся цитохромы Р-450, катализирующие окисление жирных кислот в организмах прокариот и эукариот. Гены (семь) группы V кодируют митохондриальные цитохромы Р-450, в большей части, обеспечивающие окисление стероидов. 4 гена, объединенных в группу VI, относятся к растительным, 6 генов группы VII наблюдаются только у грибов. В группе VIII (7 генов) объединены цитохромы Р-450, находящиеся в различных таксономических группах. Интересно, что ген ароматазы млекопитающих CYP19 гомологичен CYP86A1, изолированный из Arabidopsis thaliana. Более того, обнаружено, что CYP51 (стероид 14-деметилаза) распространен среди животных, растений, грибов, дрожжей и является гомологичным гену CYP54, наблюдающегося у Neurospora. Очевидно, гены цитохрома Р-450 от бактерий до человека имеют общего предшественника. Следует отметить, что в такой филогенетической расстановке генов цитохрома Р-450 не найдено места гену, кодирующему аналогичный фермент (CYP101), находящийся в Pseudomonas putida. Этот фермент выделен в кристаллическом виде и благодаря этому установлены каталитические свойства цитохрома Р-450. В эту схему также не включена NO- синтаза. По своей сути этот фермент напоминает цитохром Р-450, то есть обладает аналогичной активностью. Тем не менее компьютерный анализ его аминокислотной последовательности показал, что он не является членом суперсемейства цитохрома Р-450. Показано, что С-концевой домен NO — синтазы гомологичен семейству NADPH цитохром c редуктазы. Возможно, в процессе эволюции происходил и такой тип дивергенции белков, а отсюда и их функции. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что принципиальные черты структуры и функций цитохрома Р-450 не претерпели существенных изменений за время дивергенции бактерий, растений и животных, которая происходила более 2 млрд лет назад. В связи с этим одна из критических стадий эволюции — возникновение эффективного аэробного метаболизма, почти наверняка имела место на ранних этапах развития. В это же время, очевидно, возникли и митохондрии, выполняющие важные функции клеток. Наличие у определенного вида организмов своего набора хромосом делает актуальной задачу изучения локализации генов, кодирующих тот или иной белок (фермент). В этом плане имеются значительные успехи, касающиеся цитохромов Р-450. Доказано, что CYP1A1 и CYP1A2 находятся близко друг от друга в хромосоме 15 человека. В случае, когда два или более гена находятся в кластере рекомендовано указывать только принадлежность к семейству, т. е. "CYP1A кластер". У мышей Cyp1a1 и Cyp1a2 локализованы в хромосоме 9 и также соответствуют Cyp1a кластеру. Для указания места локализации гена в хромосоме используется известная в молекулярной биологии и генетике абривиатура: CYP1A 15q22-qter (MPI); Cyp1a Mid-9 (Mpil). Установлены пять функциональных генов у CYP2D и аналогичное количество Cyp2d (15-я хромосома). Кластер CYP2D (22q13.1) человека представлен одним геном и двумя псевдогенами [19]. Предполагается, что 5 генов крысы, образующих CYP2D кластер, возникли в результате дупликации единичного гена, т. е. увеличения общего количества ДНК в геноме, происходившей в течение 400 млн. лет [9]. После такой дупликации диплоидные клетки имеют уже не 2, а 4 гена для каждого белка. В последующих генерациях каждая пара генов может изменяться независимо. В то время как одна пара генов продолжает направлять синтез исходного функционального белка, другая пара может претерпевать относительно большие мутационные изменения и становиться ответственной за синтез белка с той же функцией, но отличающегося по специфичности или активности. В классических генетических исследованиях было показано, что часть одной хромосомы может быть перенесена (транслоцирована) в другую хромосому. Очевидно, что аналогичные транслокации происходили и в ходе эволюции при дупликации генов цитохрома Р-450. В результате таких процессов близкие гены оказались локализованными в различных хромосомах. Примером такой транслокации могут быть гены человека СYP2B (19g13.1-13.2), CYP2C (19g12-g13.2) и CYP2D (10g24.1-24.3), образующие одно семейство. Наиболее древний ген СYP51представлен соответствующим кластером у человека СYP51 (7-я хромосома) и двумя псевдогенами CYP51P1 (3-я хромосома) и CYP51P2 (13-я хромосома). В токсикологических и фармакологических исследованиях в качестве экспериментальных животных наиболее часто используют различные линии крыс и мышей. Для них установлен изоформный состав цитохрома Р-450, основные представители которых, представлены в табл. 3. Из нее следует, что только 3 изоформы семейства 1 (1А1, 1А2 и 1В1) и одна изоформа семейства 2 (2Е1) представлены ортологосными формами у человека и грызунов. Это означает, что названные изоформы локализованы во всех трех видах млекопитающих. Однако и для них характерна видовая специфичность. Так, Р4501В1 человека эффективно катализирует О-деэтилирование этоксирезорфина, в то время как аналогичная изоформа мышей абсолютно неактивна в этих реакциях. Отмечены значительные различия между Р4501А2 человека, с одной стороны, мышиными и крысиными, с другой, по отношению к варфаринмонооксигеназной активности [20]. Очевидно, такая видовая специфичность ортологосных изоформ объясняется различием в их аминокислотном составе (табл. 3). Характерной особенностью цитохрома 1А1 является его способность окислять плоские молекулы полициклических ароматических углеводородов в конформационных закрытых позициях. В результате таких реакций образуются ареновые окислы, которые недоступны для эпоксидгидролаз, превращающих их в соответствующие трансдигидродиолы. Отсюда вероятность взаимодействия таких реакционноспособных метаболитов ковалентно связываться с белками и нуклеиновыми кислотами, что обусловливает их цитотоксическое , мутагенное и канцерогенное действие.Изоформа Р4501А2 отличается субстратной специфичностью, катализируя процессы N-гидроксилирования полиядерных ароматических аминов, которые также в организме образуют реакционноспособные метаболиты. Что касается Р4501В1, то эта изоформа цитохрома по субстратной специфичности в большей степени напоминает Р4501А1 [20]. Цитохром Р4502Е1 катализирует реакции окисления различных углеводородов — производных бензола, стирола, четыреххлористого углерода, хлороформа, дихлорметана, хлорвинила, этилкарбомата, акрилонитрила. В результате таких метаболических превращений образуются токсические соединения [21]. Цитохром Р4502Е1 является практически единственным ферментом, ответственным 3 сек образование в организме гепатотоксических метаболитов из ингаляционных анестетиков [22]. С этой изоформой гемопротеина связаны и этанолокисляющие свойства, поскольку наряду с алькогольдегидрогеназой он окисляет спирт до ацетальдегида.
В заключение хотелось бы отметить, что наряду с информацией, содержащейся в печатных изданиях, существуют и электронные версии, дающие исчерпывающую информацию как по общим вопросам, так и по отдельным изоформам цитохрома Р-450. В частности, рекомендуется [9] использовать следующие банки данных в интернете: Литература |