ПРОБЛЕМНІ СТАТТІ УДК 616.831:616.98 ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ПРИОНОВОЙ ПРОБЛЕМЫ: ИНФЕКЦИОННЫЕ СВОЙСТВА, НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ И ДИАГНОСТИКАС.В. Веревка, к.б.н. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, г. Киев Спонгиформные энцефалопатии составляют редкую группу нейродегенеративных заболеваний, получивших в последнее время широкую известность вследствие беспрецедентной по размаху эпизоотии крупного рогатого скота и связанной с ней вероятностью передачи заболевания алиментарным путем от животного к человеку [1, 2]. Заболевание отличается уникальной, не имеющей аналогов, природой инфицирующего агента — так называемой патогенной формы прионового белка (PrPSc) — изоформы присутствующего у всех млекопитающих мембранного белка нервных клеток [3, 4]. Единственное отличие между нормальной и патогенной формами состоит в способе укладки полипептидной цепи [5]. Существование лишенного нуклеиновых кислот инфицирующего агента вызывает целый ряд нерешенных вопросов, связанных с молекулярными механизмами формирования прионовых заболеваний и составляет одну из интереснейших загадок современной биохимии [6-8]. Вместе с тем возможность массового инфицирования населения мясом и мясопродуктами больных животных придает прионовой проблеме острую социальную значимость и требует неотложных практических мер. Понятно, что эффективность таких мер напрямую зависит от степени изученности свойств инфицирующего агента. Данная работа является попыткой обобщения известных данных, касающихся практических вопросов, обусловленных необычными свойствами чисто белкового патогена, в первую очередь касающихся инфекционных свойств прионового белка, молекулярных механизмов его нейродегенеративного действия, существующих способов и возможных подходов к его выявлению. I. ИНФЕКЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ПРИОНОВОГО БЕЛКА Имеющиеся данные свидетельствуют о качественном отличии PrPSc от традиционных болезнетворных агентов не только по химическому строению, но и по целому ряду свойств, в комплексе обусловливающих уникальную природу прионовой инфекции. В первую очередь следует отметить высокую конформационную стабильность патогенной формы прионов [9, 10] и устойчивость к протеолизу [11, 12]. Практические последствия подобной устойчивости общеизвестны: упрощение технологии приготовления белковых добавок обусловило массовое инфицирование крупного рогатого скота в Великобритании с последовавшими тяжелейшим кризисом животноводства в странах Западной Европы, запретом на производство и использование целого ряда пищевых, медикаментозных и косметических препаратов из сырья животного и донорского происхождения. Характерной чертой спонгиформных энцефалопатий является длительный латентный период. В случае наиболее распространенного заболевания — болезни Крейцфельда-Якоба (БКЯ) — между инфицированием реципиента и началом наблюдаемой стадии болезни проходят годы, а иногда и десятилетия [6, 13-15]. Максимальная концентрация патогена и последующее развитие нейродегенеративных процессов наступают задолго до клинических проявлений заболевания [16]. По всей видимости, переход от латентного инкубационного периода к прогрессирующей деградации нервных клеток сопряжен с локальным концентрированием патогенных прионов [17], причем зависимость продолжительности латентного периода от размера исходной инфекционной дозы невелика и носит выраженный нелинейный характер [18]. Совместно с малой иммуногенностью [19, 20], способностью диффундировать через клеточные мембраны и накапливаться внутри нервных клеток [11, 21, 22], отмеченные свойства обеспечивают долгосрочную циркуляцию PrPSc в организме, что, в свою очередь, позволяет сделать вывод о присущей прионовой инфекции способности к кумуляции и, как следствие, возможности получения критической дозы мизерными, не поддающимися регистрации, частями. В силу длительности латентного периода временные параметры "дискретного" прионового инфицирования особого значения не имеют. Большая продолжительность скрытого периода болезни затрудняет, если не исключает вовсе, выявление первичного источника инфекции [23]. Клиническая картина спорадической формы заболевания неотличима от инфекционной [24]. Поэтому, не исключая возможности спорадического возникновения болезни Крейцфельда-Якоба, можно предположить, что отнесение большинства известных случаев именно к этой форме [1] может быть обусловлено отсутствием информации о происхождении инфекции. Последствия подобного подхода в условиях возможного массового инфицирования очевидны и в комментариях не нуждаются. Экспериментально установлена минимальная инфицирующая доза прионового белка — количественный порог, ниже которого болезнь не развивается. В случае интрацеребрального инфицирования мышей она составляет величину порядка 105 молекул [8, 25]. Для наглядности можно отметить, что вес макового зерна (0,3 мг) эквивалентен 60 миллиардам подобных доз. По-видимому, для разных организмов минимальная инфекционная доза различна, однако едва ли ее размерность сильно варьирует: экспериментально установлено, что при пероральном введении инфекционного материала крупному рогатому скоту LD50 всего на два порядка превышает таковую для интрацеребрального инфицирования мышей [26]. Характерной особенностью прионовой инфекции является существование так называемого межвидового барьера — зависимости степени восприимчивости реципиента от видового происхождения инфицирующего агента. При этом следует отметить, что межвидовой барьер не является абсолютным и свидетельствует лишь о большей или меньшей степени резистентности данного вида организмов к прионовой инфекции из конкретного чужеродного источника [1]. Ситуация усложняется существованием доказанной генетической предрасположенности к инфицированию чужеродным агентом. По-видимому, резко обострившая прионовую проблему так называемая новая версия болезни Крейцфельда-Якоба (vCJD) [1] обусловлена прионами попавшего в пищевую сеть мяса инфицированных коров [27]. Показано выраженное отличие новой версии по целому ряду параметров (возрастной состав больных, нейродегенеративная картина и др.) [28, 29]. Выраженная генетическая предрасположенность к новой версии [30, 31] не снимает остроты проблемы, поскольку полиморфизм M129V достаточно распространен и связан, в частности, с повышенной подверженностью спорадической форме заболевания [31, 32]. Не менее тревожной проблемой, связанной с новой версией БКЯ, является отсутствие межвидового барьера для передачи инфекции от человека человеку. В условиях массового инфицирования зараженными пищевыми продуктами даже при правильном установлении и эффективном пресечении первопричины vCJD резко возрастает риск передачи инфекции от человека человеку, в первую очередь — ятрогенными путями. Типичным примером подобной передачи стали случаи массового заражения донорскими фрагментами коры головного мозга и выделяемыми из гипофиза трупов гормональными препаратами [15, 32-34]. Вероятность присутствия минорной, с точки зрения классических белковых методов, примеси PrPSc как в свободном состоянии, так и в комплексе с какими-либо белками крови превращает медикаментозные препараты донорного происхождения в объект повышенного инфекционного риска, причем риск многократно возрастает в случае интраокулярной терапии как метода, гарантированно обеспечивающего инфицирование самыми минимальными дозами [35]. Недавно обнаруженная способность патогенной формы прионов эффективно связываться с лизин-связывающими участками плазминогена [36] придает последнему свойства белка-концентратора PrPSc, что заставляет говорить о повышенном инфекционном риске препаратов на основе компонентов фибринолитической системы и плазмы крови в целом. Возможность инфицирования минорной примесью плазминоген-прионового комплекса требует разработки мер по гарантированной очистке белковых препаратов от примеси плазминогена. Одним из возможных подходов к решению данной проблемы представляется аффинная сорбция посредством отличных от лизин-связывающих аргинил-связывающих участков плазминогена [37]. Заслуживает особого упоминания высокая адгезия PrPSc к металлическим поверхностям с сохранением сорбированным на металле белком инфицирующего действия. Известны случаи массового заражения пациентов посредством внутримозговых электродов, применявшихся при лечении пациента-носителя прионовой инфекции [38, 39]. Сорбированные прионы выдержали многократную стерилизацию, что свидетельствует о неэффективности в отношении данного вида инфекции стандартных стерилизационных процедур. С другой стороны, высокая адгезия PrPSc к металлу представляется перспективным подходом к решению проблемы обеззараживания белковых препаратов: простейший расчет показывает, что площадь 1 мм2 покрывается мономолекулярным слоем прионового белка в количестве, эквивалентном 600 минимальных инфицирующих доз. Следует отметить, что при всех своих уникальных свойствах с точки зрения белковой химии патогенная форма прионового белка не является чем-то из ряда вон выходящим. В частности, в отношении конформационной стабильности и структурно-функциональной зависимости патогенная форма прионов подобна многим белковым ингибиторам протеолитических ферментов [40]. Экспериментально доказана зависимость инфицирующего действия PrPSc от конформации молекулы: малейшее нарушение этой конформации ведет к исчезновению как протеиназоустойчивости, так и инфицирующего действия [11]. Известно большое число методов, гарантировано и необратимо нарушающих конформацию белков подобного типа [12], что и требуется для уничтожения инфекции и обеззараживания медицинского оборудования. В частности, Всемирная Организация Здравоохранения рекомендует в качестве стандартных стерилизационных процедур для медицинского оборудования замачивание в 1-нормальной щелочи (1 ч, 20°С), в 12,5 % растворе хлорной извести (1 ч, 20°С), паровую стерилизацию в автоклаве (134-138°С, 18 мин) [41]. Что же до заполонивших страницы средств массовой информации высказываний о прионах, как о чем-то сверхстабильном, выдерживающем нагрев до нескольких сотен градусов и не подверженном физическим и химическим воздействиям [42], то оно характеризует компетентность их авторов, равно как и уровень аудитории, способной подобную информацию воспринять. Приведенные данные позволяют сделать вывод о качественном отличии патогенной формы прионов от инфицирующих агентов традиционных видов. Высокая стабильность болезнетворного начала, малая размерность инфекционной дозы, возможность ее накопления, стопроцентная летальность при большом латентном периоде и неэффективности стандартных стерилизационных процедур в условиях возможного массового инфицирования требуют комплекса неотложных мер по разработке и внедрению методов диагностики и профилактики прионового инфицирования. II. НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРИОНОВ Несмотря на интенсивные исследования, вопрос о механизме нейродегенеративного действия прионовой инфекции остается открытым [43]. Каким образом конформационный изомер клеточного белка вызывает необратимую деградацию и гибель клетки? Как и для объяснения механизма самовоспроизводства PrPSc, существует несколько гипотез, объясняющих токсическое действие прионового белка. Так, предполагается прямое нейротоксическое действие структуры, сформированной фрагментом 106—126 прионового белка, вследствие способности этого фрагмента к внутриклеточному накоплению и формированию амилоидоподобных фибрилл [44]. Серьезным возражением против такого объяснения представляется существование форм прионовых заболеваний, не сопровождающихся заметным накоплением белковых ассоциатов [45, 46], иными словами — амилоидирование может быть одним из следствий, но не первопричиной патогенеза [9]. Предполагается также, что нейротоксическое действие PrPSc обусловлено окислительным стрессом в нейронах, вызванного понижением уровня нормальной клеточной формы PrPC, играющей, по всей видимости, антиоксидантную роль [47]. На основании исследований прион-подобной инфекции дрожжей высказано предположение о регуляторной функции клеточной формы прионов в процессе апоптоза, причем понижение уровня PrPC ведет к смерти клетки [48, 49]. И хотя правомочность предположения о подобии механизмов прион-подобного патогенеза дрожжевых клеток и клеток центральной нервной системы представляется дискуссионной, следует отметить апоптический характер отмирания нейронов головного мозга PrPSc-инфицированных морских свинок [50]. С другой стороны, лишенные гена прионового белка трансгенные мыши вполне жизнеспособны и каких-либо видимых патологий не проявляют [51]. По всей видимости, биосинтез собственного прионового белка является необходимым условием развития прион-опосредованного патогенеза: лишенные гена прионового белка трансгенные мыши не восприимчивы к инфицированию PrPSc [51]. Характерно, что биосинтез ряда генетически "укороченных" форм прионового белка также оказывается достаточным для развития патогенного процесса [52, 53]. Продолжительность латентного периода прионовых заболеваний хорошо коррелирует с генетически обусловленой скоростью синтеза прионового белка [54]. При отсутствии собственного биосинтеза прионового белка внесенный PrPSc не токсичен: прививка взятых от оверэкспрессирующих PrPC мышей фрагментов головного мозга трансгенным животным, лишенным гена прионового белка, с последующим инфицированием привели к интенсивному развитию патологии и накоплению PrPSc в донорных фрагментах без повреждения окружающих тканей хозяина даже несмотря на доказанную миграцию патогена из пораженной области [55]. Приведенные данные свидетельствуют об отсутствии доказанного и общепринятого объяснения токсического действия прионового белка. Это связано не только с нерешенностью вопроса о механизме самовоспроизводства патогенной формы прионов, но и с усложняющим выяснение причинно-следственных связей наложением друг на друга ряда взаимообусловленных и прогрессирующих нейродегенеративных процессов. Так, в качестве одной из возможных причин прионового патогенеза предполагается прямое или опосредованное нейротоксическое действие астроцитов [56, 57]. Однако при этом остаются необъясненными обусловленные заболеванием причины развития астроцитоза. Ряд свойств патогенной формы прионов позволяет предположить способность PrPSc к связыванию и трансмембранному переносу внеклеточных протеиназ [58]. Подобное предположение сводит как нейродегенеративное действие, так и воспроизводство патогенной формы прионов ко взаимообусловленной последовательности известных для спонгиформных энцефалопатий клеточных процессов — активации внутриклеточных проферментов, протеолитическому повреждению шапероновой системы клетки и структурированию новосинтезируемого прионового белка в наружной клеточной мембране [40]. Именно повреждение шапероновой системы с последующим мембранным фолдингом обусловливают формирование конформации патогенных прионов нового поколения и превращают инфицированную клетку в долгоживущий бридер — размножитель патогенной формы прионов. Дальнейшее развитие физиологически необоснованного внутриклеточного лизиса приводит к напоминающим апоптические процессы хроматолизу, вакуолизации протоплазмы и пикнозу ядер с последующей гибелью клетки [40, 58]. Гидрофобность сформированной мембранным фолдингом поверхности обусловливает легкое встраивание PrPSc в мембраны, формирование амилоидов и высокую адгезию к металлическим поверхностям. Той же причиной объясняется и способность PrPSc связывать внеклеточные протеиназы вследствие формирования на поверхности белковой молекулы структур, адекватных участкам высокоспецифического межбелкового распознавания. По-видимому, простейшим типом подобных структур является 1-X-3 мотив, состоящий из расположенных в должной конформации двух значащих аминокислот, разделенных несущественной третьей [59]. В силу своего назначения структуры подобного типа крайне редки и в физиологических условиях формируются только в функционально заданных участках. По всей видимости, недопущение физиологически неуместного формирования подобных структур составляет одну из важнейших задач шапероновой системы клетки. Мембранный же фолдинг, будучи нефизиологическим процессом, подобного ограничения не имеет. Связывание PrPSc лизин-связывающими участками плазминогена доказывает формирование как минимум одной связываемой детерминанты 1-X-3 типа на поверхности патогенной формы прионового белка [35, 59]. Представляется вероятным, что существование множественных форм прионовых заболеваний связано с формированием на поверхности PrPSc различных типов фермент-связываемых детерминант с различным характером нарушения внутриклеточных процессов. Так, характерная для спонгиформных энцефалопатий пролиферация астроцитов [60] может быть следствием трансмембранного переноса внеклеточных протеиназ с последующей физиологически неуместной протеолитической активацией внутриклеточных факторов роста, подобно известным патогенным процессам, обусловленным чрезмерным активаторным действием протеиназ [61]. Представленные данные свидетельствуют о сложном характере нейродегенеративного действия прионовой инфекции и заставляют говорить о патогенезе спонгиформных энцефалопатий как последовательности взаимосвязанных и взаимообусловленных клеточных процессов. III. ОБНАРУЖЕНИЕ ПРИОНОВОЙ ИНФЕКЦИИ: СУЩЕСТВУЮЩИЕ СПОСОБЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ Особенности прионовой инфекции придают очевидной для любого заболевания потребности в высокочувствительном, быстром и недорогом способе выявления патогена особую остроту. Наряду с ограничительными мерами по предотвращению возможности попадания инфицированных продуктов в пищевую сеть, а биологического и донорного сырья — в технологический цикл фармацевтической промышленности и медицины, требуется метод, пригодный для массовой лабораторной диагностики. Помимо увеличения риска инфицирования алиментарным или ятрогенным путем, резко возросла вероятность передачи инфекции от человека человеку. Скрытый переход от инкубационной фазы к прогрессирующей превращает больного в опасного для окружающих носителя инфекции. Малая размерность инфицирующей дозы, способность патогена к проникновению через клеточные мембраны (в частности — конъюктиву глаза) и длительная протяженность латентного периода в условиях возможного массового инфицирования пищевыми продуктами еще более обостряет проблему. В отсутствие пригодного для массового использования диагностикума относительная редкость заболевания создает высокую вероятность ложного диагноза, заведомо неэффективного лечения, несоблюдения специальных защитных мер и невыявления цепи передачи заболевания. Разработка аналитического метода затруднялась необычной природой и малой иммуногенностью патогена. Несмотря на актуальность вопроса, сколько-нибудь пригодные для выявления прионового патогена методы появились лишь в последние годы. Первоначально характер заболевания определялся по морфологическим изменениям при посмертном вскрытии с прокрашиванием амилоидных новообразований конго красным. Характерная картина деградации обусловила название группы заболеваний как губчатых энцефалопатий, прохождение же инфекции сквозь бактериальные фильтры привело к ошибочному отнесению патогена к вирусам или вирионам. Отсюда же — неправильное, но до сих пор повсеместно употребляемое в русскоязычной литературе название медленных вирусных болезней. Более обоснованным является применяемое во всем мире определение этой группы заболеваний как медленных трансмиссивных. Исследование болезни, путей ее переноса и природы патогенного агента потребовало воссоздания картины заболевания в лабораторных условиях с применением подопытных животных. В частности, классические работы Д. Гайдушека проводились с инфицированием полученным от погибших от "куру" людей материалом обезьян 29 видов, из которых только 9 оказались восприимчивыми. В зависимости от вида, временной промежуток между инфицированием животного и появлением признаков заболевания составлял от 14 до 39 мес для шимпанзе и до 8 лет 5 мес для макаки резус [62]. Понятно, что подобные временные промежутки исключали какое-либо практическое применение метода. Существенный прогресс в исследовании природы болезни был достигнут после разработки методики инфицирования мышей скрепи: для обнаружения инфекции и определения ее дозы требовалось 12 мес и 60 мышей [63]. Последующее ускорение и упрощение метода связано с инфицированием золотистых сирийских хомяков: временной промежуток сокращался до 70 дней, причем определение корреляции между инкубационным периодом и инфекционной дозой обеспечивало характеризацию образца использованием 4 животных [64]. Эта методика обеспечила проведение ставших классическими исследований группы Прузинера [63, 64], однако для задач практической диагностики оставалась малопригодной. Столь же малопригодным представляется использование трансгенных мышей, ускоренно экспрессирующих прионовый белок заданного типа и отличающихся как высокой восприимчивостью к инфекции, так и сокращенным инкубационным периодом [18]. Более перспективным представлялась разработка иммуноферментных методов, отличающихся как высокой чувствительностью по отношению к определяемым белкам, так и резким сокращением времени определения. Основное затруднение при этом состояло не столько в малой иммуногенности патогенной формы прионов, обходимое увеличением количества вводимого белка [64], сколько в обеспечении безошибочного выявления PrPSc в присутствии нормальной клеточной формы. Иными словами, требовались антитела, способные распознавать поверхностные эпитопы, имеющиеся у патогенной формы прионов и отсутствующие у нормальной [16]. Подобному требованию в полной мере отвечали моноклональные антитела 15В3, преципитировавшие только патогенную форму прионов быка, человека и мыши и не взаимодействовавшие с клеточной формой [65]. Впоследствии появились пригодные для практического применения коммерческие наборы для иммуноферментного определения PrPSc, превосходящие по чувствительности традиционное определение прионового титра мозговых гомогенатов крупного рогатого скота инфицированием мышей по крайней мере на порядок [26]. Не менее перспективным подходом представляется комбинированное использование уникального комплекса свойств патогенной формы прионового белка [16]. Так, высокая протеиназоустойчивость PrPSc совместно со склонностью к формированию агрегатов позволили существенно упростить иммуноферментную процедуру определения [66]. Помимо упрощения метода, существенное преимущество описанного подхода состоит в возможности использования антител к синтетическим эпитопам простейшего, линейного, типа, получаемым гораздо легче, чем используемые для наработки моноклональных антител 15В3 эпитопы сложного дизайна [65]. В то же время следует отметить, что удержание прионового белка нитро- и ацетил-целлюлозными микропористыми мембранами может объясняться не столько формированием межбелковых ассоциатов, сколько присущей PrPSc адгезии к гидрофобным поверхностям, проявившейся, в частности, в известных случаях инфицирования интрацеребральными электродами [38, 39]. Сродство патогенной формы прионов к гидрофобным поверхностям может быть объяснено структурированием прионового белка гидрофобным липидным бислоем клеточной мембраны [40]. Понятно, что такое сродство совместно с протеиназоустойчивостью PrPSc открывает перспективы для поиска методических подходов с целью разработки соответствующих диагностикумов. Еще один подход к определению прионовой инфекции связан с обнаружением в моче пораженных PrPSc людей, крупного рогатого скота и хомяков значительных количеств протеиназоустойчивого белка (UPrPSc), зффективно связываемого моноклональными антиприоновыми антителами 3F4 и 6H4 [67]. По молекулярной массе новый белок несколько превосходит известные прионовые формы и не обладает регистрируемой инфекционностью. До определения первичной последовательности UPrPSc вопрос о его природе остается открытым. Является ли он новой изоформой прионового белка или это новый белок, сформированный мембранным фолдингом вследствие повреждения шапероновой системы клеток, покажет ближайшее будущее. В любом случае, наличие подобного сопутствующего фактора, обнаруживаемого задолго до появления клинических признаков заболевания, создает в высшей степени перспективные подходы для выявления прионовой инфекции как у человека, так и животных. Таким образом, согласно приведенным данным, в последние годы появились методические подходы, существенно облегчающие разработку высокочувствительных и пригодных для массового применения методов обнаружения прионовой инфекции. Представленные материалы позволяют сделать вывод о качественном отличии PrPSc от патогенных агентов традиционного типа не только по химическому строению, но и по целому ряду свойств, требующих разработки и внедрения особых методических подходов по предотвращению возможного массового инфицирования населения. Литература |