|
ТОКСИНИ МІКРООРГАНІЗМІВ УДК 579.841.11.114 СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНДОТОКСИНОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ (обзор)Л.Д. Варбанец д.б.н., Н.В. Винарская Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев Известно, что эндотоксины — теплостабильные продукты, присущие только грамотрицательным бактериям, обладают широким спектром биологической активности и способны оказывать токсическое действие на организм животных и человека. В настоящее время септический шок, вызванный эндотоксинами грамотрицательных бактерий, продолжает оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и стабильно высокой летальности. Это происходит в результате увеличения доли инфекций, вызываемых условно-патогенными, а также неферментирующими бактериями, такими как Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae и др. Неоправданное использование комбинированной антибиотикотерапии и ряда новых препаратов ультраширокого спектра действия обусловили появление прежде крайне редко встречающихся при сепсисе микроорганизмов, таких как Enterococcus faecium, Stenotrophomonas maltophilia, Flavobacterium spp. Вместе с тем эндотоксины способны оказывать и благотворное влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к бактериальным и вирусным инфекциям. По данным [1], эндотоксины важны для нормального развития и функционирования иммунной системы организма. Для того чтобы выяснить, каким образом эндотоксины осуществляют столь разнообразное действие, необходимо знать их химический состав, структуру, конформацию, топологию в клетке. В 1935 г. Boivin и Mesrobeanu [2], используя метод экстракции клеток трихлоруксусной кислотой, показали, что эндотоксин представляет собой макромолекулярный комплекс из белка, липида и полисахарида. Спустя 20 лет Westphal и Luderitz [3] разработали водно-фенольный метод изолирования эндотоксина из грамотрицательных бактерий и провели свои классические исследования по биохимии эндотоксина. Полученный ими полимер по своей биологической активности был подобен эндотоксину, экстрагируемому трихлоруксусной кислотой, однако в отличие от последнего, состоял в основном из углеводов и жирных кислот. Таким образом, эндотоксины с химической точки зрения являются липополисахаридами (ЛПС). ЛПС — основные компоненты внешней мембраны грамотрицательных бактерий и локализованы исключительно на ее внешней поверхности. Внутренняя поверхность внешней мембраны содержит другой тип липидов: глицерофосфолипиды [4, 5]. В то время, как монослой глицерофосфолипида является текучим при нормальных температурах и в значительной степени напоминает термальное поведение глицерофосфолипидного бислоя в цитоплазматической мембране, монослой ЛПС имеет высокоупорядоченную квазикристаллическую структуру с очень низкой текучестью [6-8], в котором молекулы ЛПС связаны посредством ионных мостиков из дивалентных катионов Mg2+, Ca2+. Высокоупорядоченная структура слоя ЛПС во внешней мембране ограничивает поступление гидрофобных веществ, таких как соли дивалентных катионов, литические ферменты, некоторые антибиотики. В то время как пориновые каналы позволяют диффундировать через внешнюю мембрану низкомолекулярным веществам (до 600 Д), таких как моно- и дисахариды, более высокомолекулярные и все гидрофобные вещества эффективно удерживаются внешней мембраной многих бактерий, таких как представители Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и др. [5, 7]. Поэтому грамотрицательные бактерии гораздо менее чувствительны к гидрофобным антибиотикам, чем грамположительные. Минимальные ингибирующие концентрации большого числа гидрофобных ингибиторов для "дикого типа" штаммов E. coli и Salmonella typhimurium в 10-1000 раз выше, чем для дефектных по структуре внешней мембраны их мутантов или грамоположительных бактерий [4-6, 9]. ЛПС играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной клетки с окружающей средой, а в случае патогенных микроорганизмов — с организмом-хозяина, по отношению к которому они проявляют себя как эндотоксины и антигены. Поскольку ЛПС представляют собой основные теплостабильные поверхностные антигены бактериальной клетки, их называют О-антигенами, и они играют важную роль в серотипировании ряда видов грамотрицательных бактерий. В настоящее время в зависимости от специфических свойств или функций, которые выполняются этими биополимерами, используют три названия: эндотоксины, ЛПС, О-антигены. ЛПС представляют собой семейство структурно родственных амфифильных макромолекул, которые характеризуются общим построением. Полная макромолекула ЛПС состоит из полисахаридной части — О-специфической цепи (О-антиген, ОПС) и олигосахарида кора, ковалентно связанного с липидной частью, названной липидом А, при помощи которого молекула заякоривается во внешнем слое внешней мембраны [10]. Липид А и олигосахарид кора считаются относительно консервативными в филогенетическом отношении структурами, в то время как ОПС цепи характеризуются чрезвычайной вариабельностью. Такая структура ЛПС — S-форма продуцируется гладкими бактериальными фенотипами, представителями Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae. Микроорганизмы, являющиеся искусственно полученными или природными R-мутантами (шероховатые фенотипы многих видов Acinetobacter, Bordetella, Campylobacter, Bacteroides, Neisseria, Haemophillus, Chlamydia) синтезируют R-ЛПС, в молекуле которых отсутствует О-полисахаридный фрагмент. Химический анализ R-мутантов бактерий, представителей Enterobacteriaceae (E. coli, Salmonella enterica), дефектных по биосинтезу ОПС, позволил дифференцировать ряд хемотипов: Ra, Rb, Rc, Rd и Re [11]. Ra описывает ЛПС, содержащий полную структуру олигосахарида кора, в то время как Re представляет минимальную структуру ЛПС, состоящую только из липида А и дисахарида 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты. Большинство же "дикого типа" штаммов бактерий продуцирует S-, R-, а также переходные SR -формы ЛПС. Поскольку каждый из участков молекулы ЛПС — ОПС, олигосахарид кора и липид А содержат высокоспецифичные составные компоненты, проявляют различную биологическую активность, находятся под отдельным генетическим контролем и имеют различную таксономическую значимость, мы остановимся на рассмотрении каждого из компонентов отдельно. ЛИПИД А Липофильная часть молекулы ЛПС представляет липид А. Он был впервые описан в 1954 г. [11, 12] в качестве гидрофобного нерастворимого в воде осадка, полученного при кислотной деградации молекулы ЛПС. Термин липид А был введен с целью отличить его от другого, связанного с ЛПС липида В, который был идентифицирован как фосфатидилэтаноламин [13, 14]. Липид А представляет собой ковалентно связанный с углеводной частью компонент ЛПС. У бактерий не существует свободный от полисахарида липид А. Это обусловлено тем, что при биосинтезе к молекуле предшественника липида А молекула 2-кето-3-дезоксиоктоновой (КДО) кислоты переносится раньше, чем завершится сборка структур липида А. Так как до настоящего времени неизвестны ферменты, расщепляющие связь между полисахаридной и липидной частями, свободный липид А может быть получен только в результате мягкого кислотного гидролиза ЛПС, поскольку кетозидная связь между коровым олигосахаридом и липидом А является одной из наиболее кислотолабильных связей, обнаруженных в природе. Липид А является фосфолипидом необычного типа. В основе структуры липида А большинства исследованных бактерий и, в частности, всех энтеробактерий, а также представителей родов Haemophilus и Providencia, находится гидрофильный скелет, построенный из двух бета-1,6-связанных остатков Д-глюкозамина, который фосфорилирован в положение 1 остатка GlcN I и положение 4' остатка GlcNII. Обе аминогруппы и гидроксильные группы в положениях 2' и 2, 3' и 3, соответственно, ацилированы остатками линейных (R)-3-гидроксиалкановых кислот, содержащих от С12 до С16, гидроксильные группы которых в свою очередь могут быть ацилированы жирными кислотами С10-С18 или (S)-2-гидроксидодекановой кислотой (2ОН-С12:0). Однако эти заместители не являются важными для эндотоксической активности. Типичными структурными маркерами ЛПС, определяющими их биологическую активность, являются ацилоксиацильные остатки при 2'- и 3'-положениях нередуцирующего глюкозамина. Поскольку 3-оксижирные кислоты, связанные как эфирными, так и амидными связями, преобладают среди жирных кислот липида А (до 65 %) и отсутствуют в других липидах бактерий, они могут служить своеобразными маркерами липида А. Необычная гидроксилированная длинноцепочечная жирная кислота, названная 27-окси-октакозановой (27-ОН-28:0), была обнаружена в липиде А Rhizobium trifolii [19]. Она отличается от обычных жирных кислот тем, что содержит углеводородную цепь, которая в 2 раза превышает обычную длину, а также несет функциональную группу ОН в предпоследнем (27) положении углеводородной цепи, а не в положении 3. Предполагают, что эта жирная кислота пересекает внешнюю мембрану и взаимодействует с компонентами внутреннего слоя внешней мембраны, такими как фосфолипиды и белки. Это может привести к более стабильному заякориванию ЛПС и, таким образом, повышать стабильность и ригидность внешней мембраны. Все исследованные виды семейства Rhizobiaceae, за исключением единственного представителя Azorhizobium caulinodans, содержат 27-ОН-28:0 кислоту во фракции липида А [19, 20]. В настоящее время ее точная локализация в липиде А установлена только у ряда видов: у Sinorhizobium (ранее Rhizobium) meliloti она присоединена эфирной связью к C3' нередуцирующего глюкозамина, у R. trifolii ANU 843 — амидной связью к глюкозаминоуроновой кислоте, у R. phaseoli — к галактозаминоуроновой кислоте [20, 21]. Необходимо отметить, что внутри препарата липида А одного и того же штамма бактерий существует умеренная естественная гетерогенность, обусловленная различной степенью замещения фосфатных групп полярными группами. Эта гетерогенность обусловлена неполным биосинтезом и/или процессом деградации при выделении липида А. Фосфатные группы в С1 и С4' дисахаридного скелета липида А могут нести различные типы полярных групп [22, 23]: отрицательно заряженные (фосфат, пирофосфат, галактуроновая кислота), положительно заряженные (4-амино-4-дезокси-L-арабинопираноза, этаноламин, глюкозамин), а также цвитерионные группы (2-амино-этилфосфат). В ряде случаев были идентифицированы нейтральные заместители, такие как D-арабинофураноза, L-глицеро-D-манно-гептопираноза и бета-D-маннопираноза. Отсутствуют экспериментальные данные об участии полярных групп в проявлении эндотоксических свойств липида А. Однако, они могут играть важную роль в организации и проницаемости внешней мембраны, а также в устойчивости бактерий к определенным антибиотикам, в частности, полимиксину В [24-27]. В составе липидов А ряда бактерий отсутствуют фосфаты. В табл. 1 приведены известные в настоящее время их заместители: альфа-d-галактуроновая кислота, бета-d-маннопираноза, l-глицеро-d-манногептопираноза. Поскольку во время биосинтеза липида А тетраацил-глюкозамин-дисахарид-1-фосфат является предшественником, который под действием 4'-киназы превращается в тетраацилдисахарид, ясно, что фосфорилирование завершается раньше, чем единицы КДО и жирные кислоты присоединятся. Предполагая подобный механизм биосинтеза ЛПС у неэнтеробактериальных видов, можно заключить, что отсутствие фосфатных остатков является, вероятно, результатом вторичного процесса. Различия в структурах липида А зависят также от количества (гепта-, гекса-, пента- и тетра-) присутствующих жирных кислот и от их распределения в дисахаридном скелете: асимметричное [(4+2) (E. coli, Rhodospirillum fulvum)] или симметричное [(3+3) (Rhodobacter capsulatus, Chromobacterium violaceum)]. Как правило, первичные жирные кислоты липида А являются бета-гидроксилированными и известно только несколько исключений: 3-оксо-жирные кислоты [С14:0 (3-оксо)] у Rhodopseudomonas sphaeroides и Rhodobacter capsulatus (положение 2 и 2', соответственно) [28]; негидроксилированные жирные кислоты, которые присоединяются непосредственно к дисахаридному скелету у C. trachomatics [29]. Cпециального обсуждения заслуживает обнаружение олефиновых жирных кислот. Эти кислоты являются исключительно вторичными, таким образом образуя ацилоксиацильные остатки. Конфигурация додеценовой кислоты (С12:1), присоединяемой к 3-ОН-С10:0 у R. capsulatus [30], была недавно определена как цис [31]. Ждёт решения проблема установления конформации тетрадеценовой кислоты (С14:1) липида А R. sphaeroides, которая в приводимых структурах присутствует в виде трансконфигурации [32-35]. Недавно были охарактеризованы мутанты, которые синтезируют ЛПС, содержащий не полностью ацилированный липид А. Показано [36, 37], что у msbB мутанта E. coli отсутствует миристоил-трансфераза, функционирующая на поздней стадии ацилирования при биосинтезе липида А. Это приводит к образованию пентаациллипида А с додеканоилокситетрадекановой кислотой [С14:0(3-О(12:О)] в качестве единственного амидносвязанного ацилоксиацильного остатка [38]. Эта мутация не была летальной для роста, таким образом указывая, что функционирование и стабильность внешней мембраны поддерживаются ЛПС, содержащим пентаацилированный липид А. Пентаациллипид А обнаружен в препаратах липида А, изолированных из Re ЛПС E. coli [39, 40]. Он представляет минорную фракцию не только в липиде А ЛПС E. coli, но также Salmonella enterica sv. minnesota (Re мутант) [41] и Neisseria gonorrhoeae [42]. Недавно был сконструирован waaN-мутант S. enterica sv. typhimurium, который содержит S-ЛПС, но синтезирует пентаациллипид А, характеризующийся сниженной токсичностью [43]. Как было показано ранее, углеводный скелет большинства исследованных липидов А представлен дисахаридом глюкозамина. Однако существуют его вариации, обусловленные наличием: 1) 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкозы (Rhodopseudomonas viridis, R. palustris, Thiobacillus ferrooxidans, T. thiooxidans, Campylobacter jejuni, Brucella abortus, B. melitensis, Pseudomonas diminuta, Phenylobacterium immobile) [44-48]. Скелет липида А с диаминоглюкозой может существовать в форме как моно-, так и дисахарида; 2) D-глюкозаминоуроновой кислоты (Rhizobium trifolii); 3) галактуроновой кислоты (R. leguminosarum bvs. phaseoli, trifolii, vicea); 4) галактуроновой кислоты и глюкозамина (R. leguminosarum). Приведенные данные свидетельствуют о вариабельности структуры липида А в отличие от ранее существовавшего мнения о том, что липид А является наиболее консервативной частью молекулы. Такая вариабельность, по-видимому, дает основание предположить, что термин липид А не определяет молекулярную сущность, обладающую единственной определенной структурой, а скорее описывает липоидную зону ЛПС, которая представляет его токсический компонент, важный в организации и функционировании внешней мембраны бактерий. Химический синтез липида А В современных исследованиях ЛПС для выяснения взаимосвязи функции липида А, являющегося эндотоксическим центром ЛПС, и его структуры, важны работы по химическому синтезу. Опыт первого химического синтеза липида А, осуществлённый в 1982-1987 гг. группой японских исследователей [49-51], имеет важное значение, поскольку синтетическое вещество, соответствующее структуре липида А E. coli F 515, показало полностью идентичную с ним эндотоксическую активность [52, 53]. То-есть, предполагаемая структура липида А была химически сконструирована de novo [49, 50]. Этот результат окончательно доказал, что липид А является эндотоксическим центром ЛПС. Теоретически стало возможным синтезировать любое родственное липиду А соединение и изучать взаимоотношения между определенной химической структурой и биологической функцией. Действительно, антагонистическая активность по отношению к ЛПС и липиду А впервые была обнаружена у химически синтезированного биосинтетического предшественника липида А [54-57], который был идентифицирован как предшественник Iа или липид IVA. Это вещество имеет ту же структуру гидрофильного скелета: бифосфорилированный бета(1—>6)-дисахарид, что и природный липид А, однако содержит на два остатка жирных кислот меньше, чем последний, и несет только 4 (R)-3-гидрокситетрадекановых остатка в симметричном распределении. Липиды А, изолированные из бактериальных клеток, содержат только насыщенные жирнокислотные группы, большинство из которых являются 3-гидроксилированными. Вместе с тем известны липиды А, содержащие двойную связь. Согласно структурным исследованиям [58, 59], липид А Rhodobacter sphaeroides характеризуется тем же гидрофильным скелетом, что и E. coli, но содержит необычную амидосвязанную 3-кетокислоту вместо 3-гидроксикислоты, обычно обнаруживаемой в других липидах А. Более того, у другой аминогруппы была обнаружена ненасыщенная жирная кислота. Поскольку липид А R. sphaeroides является сильным антагонистом и угнетает эндотоксическое действие других липидов А и ЛПС, авторы [60] разработали новый метод синтеза. Однако, неожиданно оказалось что ни один из синтетических продуктов (цис или транс изомеров двойной связи, синтезированных отдельно) не являлся идентичным естественному липиду А R. sphaeroides. Тем не менее, в результате синтеза было получено вещество 9, которое в опытах in vivo сильно угнетало образование ФНО-a, индуцируемое ЛПС в моноцитах человека. Это наблюдение привело к дизайну молекулы 13, основанной на структуре 9, и проявляющей антагонистическое действие. После синтеза липида Х, представляющего собой Д-глюкозаминил-1-фосфат, несущий 2 молекулы 3-окситетрадекановой кислоты, одна из которых присоединена к амино-, а другая — к гидроксильной группе, как биосинтетического предшественника липида А, N,O-диацилированные глюкозамин-1- и 4'-фосфаты, соответствующие обеим половинкам липида А, были синтезированы. Среди них ряд монофосфатов, таких как вещества 14 и 15, проявляющих определенную, подобную липиду А, активность. При дальнейших синтетических модификациях ацилированной моносахаридной структуры, мимикрирующей липид А, была получена серия 2,3-диацилглюкозамин 4'-монофосфатов, С1-гидроксильные группы которых ацилированы линейными дикарбоновыми кислотами различной длины цепи (вещество 16) [61]. Однако хотя ряд моносахаридных частичных структур проявляют биологическую активность, характерную для липида А, активность соответствующих дисахаридных производных была гораздо выше. Поэтому был проведен синтез веществ, имеющих замещение гликозилфосфата в бета(1—>6)-дисахаридном компоненте липида А. Первым веществом такого типа замещения был фосфонооксиэтильный аналог липида А [62]. В этой структуре фосфатная группа присоединяется через альфа-гликозидносвязанный этиленгликолевый остаток. В этом соединении три дополнительных атома находятся между глюкозамином и фосфатом были синтезированы. Полиэтиленгликолевых аналога липида А E. coli (вещество 17) и биосинтетического предшественника (вещество 18). Вещество 17 проявляет ту же активность, что и оригинальный липид А E. coli, в то время как производное 18 проявляло такую же антагонистическую активность, что и биосинтетический предшественник 2 [63, 64]. Интересно отметить, что у стереоизомера вещества 17, содержащего бета-гликозидносвязанный этиленгликоль, биологическая активность не была обнаружена [63]. Замещение гликозилфосфата другими кислотными группами с образованием структурных аналогов было проведено рядом исследовательских групп в попытках найти вещества, у которых отсутствовали бы токсические свойства естественного липида А при сохранении полезной биологической активности. Так, был синтезирован ряд дисахаридных аналогов, в которых гликозилфосфат замещен карбоксильными кислотами. Один из аналогов (вещество 23) содержал две карбоксильные кислоты, мимикрирующие дивалентную природу фосфата, в то время как другой (вещество 24) — только одну карбоксильную группу [65]. Синтезированные вещества сохраняли биологическую активность. Исследования биологической активности производных и аналогов липида А позволяют сделать следующие выводы. Эндотоксически активным является липид А с бифосфорилированным дисахаридом глюкозамина, замещенным не более чем 6 ацильными остатками. Молекулы, лишенные одного из этих компонентов или имеющие другое их распределение, заметно менее активны или вовсе не активны. Влияние углеводной основы не столь значительно, и липид А Campylobacter jejuni обладает активностью, сравнимой с липидом А E. coli, несмотря на то, что в нем один из остатков глюкозамина замещен остатком 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Д-глюкозы и содержит не 2, а 3 N-связанных остатка 3-ОН-С14:0. Моносахаридные производные, независимо от места фосфорилирования и ацилирования, не проявляют in vivo типичные активности эндотоксина, такие как пирогенность, летальная токсичность. Однако они могут быть нетоксичными стимуляторами клеток иммунной системы, поскольку способны активировать макрофаги. Таким образом, дифосфориллипид А представляет собой минимальную токсическую единицу эндотоксина, а монофосфориллипид А — молекулу, сохраняющую иммуномодулирующие свойства эндотоксина, однако лишенную его токсических свойств. Хотя до настоящего времени ни одно из синтезированных веществ не используется в клинической практике для лечения заболеваний, некоторые из них могут найти применение в ближайшем будущем. Этому способствует создание в последние 10 лет усовершенствованных методов синтеза и очистки, позволяющих получить высокогомогенные вещества от нескольких милиграмм до нескольких грамм. ОЛИГОСАХАРИД КОРА Полисахаридная часть молекулы представлена связанным с липидом А олигосахаридом кора, а также ОПС. До недавнего времени считали, что химические вариации в коровой зоне значительно более ограничены по сравнению с очень вариабельными ОПС. Однако в последние 6-7 лет был достигнут значительный прогресс в структурной оценке коровой зоны ЛПС, полученных от большого количества видов бактерий. Сравнение всех известных структур позволяет сделать выводы о существовании значительной вариабельности в этой зоне. Единственным структурным элементом, который присутствует во всех ЛПС, независимо от их бактериального происхождения, является 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота (КДО) (от одного до трех остатков) или ее производное. Бактерии с дефектом в биосинтезе КДО не являются жизнеспособными. Это указывает на то, что КДО (как и ЛПС в целом) является необходимой для структурной и функциональной целостности бактериальной клетки. Несмотря на то, что в ЛПС ряда бактерий присутствует 3 молекулы КДО, для выживания грамотрицательных бактерий достаточно только одного остатка КДО. Это было показано на мутантном штамме Haemophilus influenzae, ЛПС которого состоял из КДО-4-фосфата, присоединенного к липиду А. До настоящего времени не изолирован ни один мутантный штамм, который содержал бы только одну незамещенную молекулу КДО, присоединенную к липиду А. Таким образом, для роста и выживания бактерий необходимым является наличие двух близлежащих отрицательных зарядов в коровой зоне. Другим компонентом кора является гептоза. Коровые структуры могут быть отнесены к двум видам: содержащим и не содержащим гептозы. Большинство коров характеризуется присутствием L-глицеро-D-манногептопиранозы (L,D-Hep) или реже D-глицеро-D-манногептопиранозы (D,D-Hep) [66], которая является предшественником L,D-Hep [67], в составе некоторых — присутствуют оба типа. Гептозосодержащие коры известны двух типов: 1) с общим структурным элементом L,D-Hep-(1—>7)-L,D-Hep-(1—>3)-L,D-Hep-(1—>5)-aльфа KDO, в котором О-3 Hep II замещен глюкозой. Остатки гептозы фосфорилированы, а положение О-4 Hep I не замещено моносахаридом. Такой тип кора характерен для Salmonella enterica, E. coli, Shigella, Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Erwinia carotovora; 2) олигосахарид кора другого типа содержит частичную структуру L,D-Hep-(1—>7)-L,D-Hep-(1—>3)-L,D-Hep-(1—>5)-a KDO, не замещенную в положение О-3 Hep II глюкозой. Остатки гептоз нефосфорилированы и положение О-4 Hep I замещено остатком гексозы или олигосахарида. Такой тип обнаружен у Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Yersinia. Кроме того известна группа бактерий (представителей Neisseria, Vibrionaceae, Aeromonas, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Campylobacter, Helicobacter, Miscellaneous), которые содержат 4 остатка гептоз, однако конформация некоторых из них неизвестна. Вторую группу бактерий составляют представители Moraxellaceae, Rhizobiaceae, Chlamydia, в составе кора которых гептозы отсутствуют [68, 69]. Структурный анализ коровой зоны был затруднен в течение длительного времени вследствие: 1) сложной химии КДО (которая является полифункциональной сахарной кислотой с 8 атомами углерода, несущими карбоксильную, гидроксильную, кето- и дезоксигруппы, вследствие чего она чрезвычайно чувствительна к воздействию кислот и других химических реагентов), 2) фосфатных замещений коровых моносахаридов. Первая проблема была решена в середине 80-х гг., в то время как вторая не преодолена и до настоящего времени. С целью получить фосфорилированные олигосахариды исследователи [70] разработали путь деградации ЛПС с использованием последовательного мягкого гидролиза и сильно щелочной обработки и изолирования чистых веществ при помощи высокоразрешающей ионнообменной хроматографии, что позволило дать характеристику коров бактерий различных систематических групп [71]. Однако, фосфодиэфирные, дифосфатные, дифосфодиэфирные, ацильные и карбомильные группы, присутствующие во многих ЛПС, расщепляются в сильно щелочных условиях и поэтому их положение не может быть определено. Щелочная обработка также способствует миграции фосфата в случае замещения 2-аминоэтилфосфатом и бета-элиминированием остатка 4-замещенной галактуроновой кислоты [72]. Кор всегда присоединяется к липиду А через остаток КДО, за исключением двух штаммов Acinetobacter, в коре которых КДО замещена нестехиометрическими количествами Ко (Д-глицеро-Д-тало-окт-2-улопиранозоновая кислота) [68, 69]. Согласно современным представлениям, этот остаток КДО (а также Ко) замещен при О-4 либо дисахаридом [КДО-(2-4)-КДО у S. enterica, E. coli или КДО-(2-8)-КДО у Chlamydia] либо моносахаридом КДО (у S. enterica, E. coli, который может быть замещен фосфоэтаноламином или остатком моносахарида) или фосфатом (у Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae [73, 74]). Интересно, что присоединение в этом положении разветвленного трисахарида КДО-(2-4)-[КДО-(2-8)-]-КДО наблюдается у Chlamydia psittaci и регистрируется присутствие дисахарида КДО-(2-5)-КДО у Acinetobacter haemoliticus NCTC 10305, ATCC 17905 [68, 69] и Campylobacter lari ATCC 35221 [75]. У Acinetobacter этот дисахарид связан с липидом А, при О-4 первой молекулы КДО замещен остатком третьей молекулы КДО и при О-7 второй молекулы КДО замещен либо четвертой молекулой КДО (в шт. 10305), к которой присоединяется короткий рамногликан или бета-глюкозамин (в шт. АТСС 17905). Таким образом, до настоящего времени известны два кора, которые содержат кластер из четырех остатков КДО, близлежаших к липиду А. До недавнего времени участок кора, близлежащий к липиду А и состоящий из КДО и гептопираноз, назывался внутренним кором в отличие от внешнего, содержащего гексопиранозы. Несмотря на то, что в последние годы установлено присутствие гексопираноз во внутреннем коре и гептопираноз во внешнем, это деление пока используется исследователями [76, 77]. Внешний кор большинства бактерий содержит часто встречающиеся моносахариды, такие как глюкоза, галактоза, глюкозамин в пиранозной форме. В виде три-, пентасахарида внешний кор присоединяется к внутреннему кору и эволюционно является более вариабельной частью ЛПС. Таким образом, общий структурный компонент ЛПС представлен олигосахаридом кора и липидом А. Показано, что мутанты, не способные синтезировать кор, не жизнеспособны. О-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПОЛИСАХАРИДНАЯ ЦЕПЬ О-специфические полисахариды (ОПС) обычно характеризуются регулярной структурой, построенной из повторяющихся олигосахаридных единиц, что определяется способом их биосинтеза, в котором ранее образованные олигосахаридные блоки переносятся в растущую полисахаридную цепь. В некоторых случаях биосинтетический путь отличается от обычного и тогда моносахариды присоединяются к цепи последовательно один за другим. Однако такой путь биосинтеза функционирует крайне редко. Только для ограниченного количества О-цепей определена структура биологической повторяющейся единицы, то-есть такой, которая переносится при биосинтезе. Большинство же исследователей устанавливает структуру химических повторяющихся единиц, которые в ЛПС различных грамотрицательных бактерий характеризуются необычайным разнообразием. Компоненты О-цепи включают нейтральные моносахариды в пиранозной и фуранозной форме (гексозы, пентозы, дезокси- и О-метильные производные) и заряженные моносахариды (аминогексозы и аминопентозы, гексуроновые и гексозаминоуроновые кислоты), которые несут ряд заместителей, таких как аминоацильные, фосфорильные, глицерильные, лактильные и ацетильные группы [78]. Наиболее крупный моносахарид содержит 10 атомов углерода. В последние годы в составе ОПС обнаружены аминокислоты: серин [79], треонин [80] и аланин [81] у Proteus mirabilis 028, P. penneri 12 и 14, соответственно. У ряда видов бактерий ОПС представляют гомополимеры галактозы (Hafnia alvei Y166/91) [82], рамнозы (Klebsiella pneumoniae 22535 [83], Yersinia bercovieri 010 [84], Campylobacter fetus B [85]), маннозы (Salmonella enterica sv. Borreze 054 [86], Serratia marcescens 028 [87], Campylobacter fetus A [88], Burkholderia cepacia E02 [89], Acetobacter methanolicus MB 135 [90]), глюкозы (A. methanolicus MB 70) [91], гептозы (Burkholderia pseudomallei 304b, 824a [92]), таллозы (Actinobacillus actinomycetemcomitans a и c), [93], Rhizobium loti [94, 95]). Однако ОПС в виде гомополимеров встречаются редко. В основном они представлены гетерополисахаридами, содержащими до восьми различных остатков моносахаридов. Природа, последовательность, аномерная конфигурация, тип связи и тип замещения индивидуальных моносахаридных остатков внутри повторяющейся единицы являются характерными и уникальными для данного ЛПС и исходного штамма. Из-за разнообразия компонентов и их связей возможно существование огромного количества структур ОПС, что находит свое подтверждение в природе. Поэтому обнаруживается безмерная структурная вариабельность при сравнении О-цепей отдаленных видов бактерий [78, 96, 97]. И если длительное время изучение структуры ОПС ограничивалось только представителями семейства Enterobacteriaceae, то в последние 10-15 лет исследованы представители большинства известных таксономических групп бактерий. О-специфические цепи определяют серологическую специфичность ЛПС и содержащих их бактерий. О-иммуногенные и О-антигенные свойства ЛПС определяются так называемыми О-факторами, химическая структура которых во многих случаях установлена. Иммунодоминантными моносахаридами могут быть как 3,6-дидезоксигексозы, так и О-метилированные, О-ацетилированные или другие замещенные моно- и аминосахара или даже разветвленные моносахариды, находящиеся в терминальном положении. В ряде случаев установлена корреляция между структурой и серологическими свойствами ЛПС. Так, первая серологическая классификационная схема была предложена Кауффманом и Уайтом для представителей рода Salmonella. Установлено [96], что их серологическая специфичность обусловлена присутствием определенных заместителей (паратозы, абеквозы, тивелозы и глюкозы), присоединенных в виде боковой цепи к маннозе или галактозе в идентичном для всех представителей Salmonella трисахаридном звене (манноза, рамноза, галактоза). Однако, такая корреляция, в которой все виды сальмонелл характеризуются наличием одинакового трисахаридного повторяющегося звена, состоящего из маннозы, рамнозы и галактозы, а принадлежность к серотипу определяется терминальным моносахаридом, находящимся в боковой цепи, является уникальной и обнаружена только у представителей сальмонелл. У остальных исследованных грамотрицательных бактерий такая корреляция не выявлена, каждому серотипу большинства исследованных штаммов свойственна своя структура ОПС. Это касается представителей Shigella, E. coli, Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, P. cepacia, P. syringae [78, 96]. С целью обмануть иммунную систему хозяина бактерия в процессе эволюции изменяет состав и структуру О-цепей, что приводит к развитию все новых О-специфических активностей на клеточной поверхности. Необходимый для роста и размножения бактерий липид А с присоединенной к нему зоной внутреннего кора оказываются недоступными для узнавания клетками хозяина. Таким образом, О-специфические цепи могут защищать бактерии от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки, что позволяет им выживать и размножаться в очень неблагоприятных условиях. ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОТ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ И КОНФОРМАЦИИ МОЛЕКУЛЫ ЛИПИДА А Как известно, эндотоксическим центром ЛПС является его липид А. Установлено, что для проявления различных видов биологической активности необходима особая химическая структура липида А, построенная из бета-1,6-связанного дисахарида глюкозамина, замещенного двумя фосфатными группами (в положение 1 и 4') и 6 остатков жирных кислот определенной длины цепи (С10—С16) и асимметрично присоединенных к остаткам редуцирующего и нередуцирующего глюкозамина [99-101]. Эта минимальная структура необходима для проявления полной биологической активности ЛПС. Известно [102-106], что подобно другим активным молекулам ЛПС или свободный липид А образуют супрамолекулярные агрегаты в условиях так называемой критической концентрации мицеллярных агрегатов. Они могут иметь ламеллярную (L), неламеллярную (кубическую Q) или вывернутую гексагональную (HII) супрамолекулярную структуру. Трехмерная структура агрегатов липида А или ЛПС в значительной степени зависит от первичной химической структуры, изменения которой влияют и на физическую конформацию молекулы [104-105]. Поскольку существовало мнение об уникальной конформации липида А, определяющей его токсичность, исследователи провели сравнительное изучение эндотоксической активности ЛПС в зависимости от особенностей структуры липидов А и их трехмерной конформации (табл. 2) [103]. Изучали пирогенность на кроликах, летальность и токсичность на мышах, индукцию цитокинов in vivo и in vitro с использованием моноцитов и эндотелиальных клеток. Авторы [107-112] исследовали липиды А, включающие как бис-, так и монофосфорильные (без фосфатной группы при С1) структуры e. coli, s. minnesota, а также липиды А rhodocyclus gelatinosus, rhodobacter capsulatus, rhodopseudomonas viridis, rhodospirillum fulvum, campylobacter jejuni. Первичная химическая структура липида А R. viridis в настоящее время неизвестна в деталях. Предполагают, что он состоит из дисахаридного скелета (образованного GlcN3N), замещенного остатками амидносвязанной 3-ОН-С14:0 кислоты и эфирносвязанной гидроксилированной жирной кислоты 27-ОН-С28:0. Дисахаридный скелет, как предполагают, не замещен фосфатными группами. Обнаружено [107, 108], что липиды А Rb. сapsulatus, Rp. viridis, Rs. fulvum имеют ламеллярную структуру, бифосфорилированный липид А E. coli и S. minnesota — кубическую, а липид А Rc. gelatinosum — вывернутую гексагональную структуру, в то время как трехмерные структуры монофосфорилилипида А S. minnesota и липида А C. jejuni — смесь ламеллярной и кубической. установлено, что по сравнению с ЛПС и липидом А S. minnesota, летальное действие (ЛД50 на мышах) и пирогенность (на кроликах) на 3-4 порядка ниже у ЛПС и липида А R. capsulatus и Rp. viridis, но аналогичны ЛПС Rc. gelatinosus [113]. ЛПС Rp. viridis не способен индуцировать образование ФНО. Летальный эффект и пирогенность монофосфориллипида А S. minnesota были на 1-2 порядка ниже, чем для бифосфорильного вещества или исходного ЛПС [114-115], в то время как образование ИЛ-1 и ФНО индуцировалось аналогично [116-117]. Биологическая активность ЛПС C. jejuni, оцененная по пирогенности и способности индуцировать ФНО, была в 50-100 раз меньше, чем ЛПС Salmonella, в то время как способность липида А Rs. fulvum индуцировать образование ИЛ-6 на 3-4 порядка ниже, чем ЛПС Salmonella [118]. Тенденция липида А принимать неламеллярную (кубическую или вывернутую гексагональную) структуру, таким образом, прямо связана со способностью проявлять биологическую активность, липиды А с преобладанием ламеллярной организации либо совсем не проявляют, либо проявляют лишь незначительную активность [103, 119]. На основании этих результатов можно прийти к выводу, что основной детерминантой эндотоксичности является конформация липида А либо в свободной форме, либо в составе ЛПС. Добавление гликозильных остатков, таких как КДО и гептоза, не изменяет конформацию липида А, скорее они модифицируют критическую концентрацию агрегатов, "растворимость" (размер агрегации) в водной среде и текучесть углеводородных цепей (при 37°С) и поэтому могут модифицировать активность эндотоксина. На основании результатов, полученных при изучении липида А Rb. capsulatus и Rc. gelatinosus, становится очевидным, что текучесть не является детерминантой биологической активности. Для обоих препаратов параметр упорядоченности очень низкий (высокая текучесть), но только липид А Rc. gelatinosus, у которого преобладает гексагональная структура, является биологически активным. Однако, на основании данных по изучению липида А C. jejuni, можно говорить о модифицирующем влиянии текучести. Несмотря на то, что основная фракция липида А C.jejuni приобретает кубическую структуру, он проявляет только относительно низкую активность. Основное отличие этого липида А от остальных исследованных — очень низкая подвижность ацильных цепей (самый высокий параметр упорядоченности) [118]. В настоящее время невозможно чётко определить влияние текучести эндотоксина на его биологическую активность из-за ограниченного количества доступных данных литературы. МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛПС С КЛЕТКАМИ ХОЗЯИНА Поскольку ЛПС является уникальной молекулой, общей для всех грамотрицательных бактерий, его присутствие в клетке хозяина является сигналом для развития ответной реакции организма. Запущенный этим сигналом быстрый и сильный антибактериальный ответ может быть опосредован иммуннoй системой (цитокины и другие клеточные медиаторы). Эти вещества могут оказывать непосредственное бактерицидное действие или вовлекать в процесс другие клетки для элиминации микроорганизмов. Высокие же дозы эндотоксина или его длительное присутствие в крови, обусловленное персистенцией инфекции или фрагментов лизированных бактерий, может вызывать сверхреакцию, сопровождающуюся освобождением токсических количеств цитокинов и других клеточных медиаторов. Эта сверхреакция может способность развитию септического состояния и привести к формированию гипотензии, шока, разрушению тканей и органов. Однако до недавнего времени молекулярные основы клеточной активации были неизвестны. Решению этой проблемы послужило обнаружение СД14 рецепторов на поверхности макрофагов, моноцитов и нейтрофилов [120-121]. Другие реагирующие на ЛПС типы клеток (лимфоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) имеют очень низкие уровни СД14 или вообще их не содержат. СД14 являются рецепторными белками, которые узнают и связывают ЛПС из комплексов, образуемых мономерным ЛПС и циркулирующим ЛПС-связывающим белком. В настоящее время исследователи считают, что СД14 вначале образуют ЛПС-СД14 комплекс и переносят ЛПС к еще неидентифицированному рецептору(ам) ЛПС, чтобы начать трансдукцию сигнала. Предполагают [122], что СД14 тесно ассоциированы с сигнальным белком тирозинкиназой. В последние 10 лет сообщалось о способности многих клеточных белков связывать ЛПС и липид А [123-130]. Однако, кроме СД14, эти белки не охарактеризованы. На рисунке приведена модель, описывающая взаимодействие бактериального ЛПС с клетками, осуществляемое ЛПС-связывающим белком, мембранными (гликозилфофатидилинозит-содержащими) СД14 или растворимыми СД14 рецепторами [131]. В результате этих взаимодействий происходит активация клеток и освобождение медиаторов белковой природы, таких как ИЛ-1 или ФНО, которые последовательно усиливают ЛПС-зависимые ответы хозяина, приводящие к развитию септического шока и даже смерти. Обнаружение СД14 рецепторов, взаимодействующих с ЛПС, явилось тем ключевым событием, которое определило перспективы дальнейших исследований по выбору стратегии борьбы с заболеваниями, вызванными грамотрицательными бактериями. Эффективной может оказаться анти-ЛПС стратегия, которая основана на использовании веществ, способных конкурировать с ЛПС за специфическое связывание с СД14 рецепторами на макрофагах, моноцитах и нейтрофилах, и, таким образом, блокировать продукцию индуцируемых ЛПС цитокинов. В качестве антагонистов ЛПС могут быть использованы нетоксичные ЛПС, липиды А из нетоксичных ЛПС, синтетические липиды А, модифицированные производные, а также различные частичные структуры ЛПС, которые сами обладают только ограниченной биологической активностью, но в малых дозах способны блокировать эффекты липида А, в основном, в результате конкуренции за места связывания на рецепторах для ЛПС на белках или клетках и тем самым снижать выделение цитокинов. В последние годы внимание исследователей направлено на изучение антагонистических свойств нетоксичного пентаацилдифосфолипида А (ДФПА), производного ЛПС Rhodobacter sphaeroides. Сравнительные исследования его антагонистических свойств с другими нетоксичными ЛПС и липидами А, приведены в табл. 3. Установлено, что деацилированный ЛПС проявляет антагонистическую активность. ЛПС r. capsulatus подобен нетоксичному ЛПС из r. sphaeroides как по структуре, так и по биологической активности [132]. В структуре липида Х, оказывается, отсутствуют компоненты, ответственные за выраженную антагонистическую активность [133]. Липид iva является неактивным в клетках мышей, но может функционировать как антагонист в клетках человека [134, 135]. ДФПА r. sphaeroides является сильным антагонистом токсического ЛПС в клетках как человека, так и мышей [135-137]. Показано [136, 138], что ДФПА r. sphaeroides блокирует связывание ЛПС с предполагаемым рецептором ЛПС, не индуцируя при этом образование ФНО-альфа, ИЛ-1бета, рецептора типа ФНОР-2. На основе структуры липид А части ЛПС r. sphaeroides и r. capsulatus был создан синтетический трансмембранный липид А-вещество Е5531, который является сильным антагонистом токсического ЛПС. Аналогично ДФПА r. sphaeroides, он имеет критические структурные характеристики, необходимые для сильной антагонистической активности. Это пентаацилдифосфориллипид А, который содержит относительно короткие жирные кислоты (ОН-С10). Однако, наиболее сильным из известных антагонистов токсических ЛПС исследователи считают ДФПА r. sphaeroides. Каким образом ДФПА R. sphaeroides блокирует сигнальную трансдукцию при активации макрофагов, моноцитов и нейтрофилов? Теоретически можно предположить что: это угнетение происходит на двух уровнях. На первоначальном уровне оба, как токсический ЛПС, так и ДФПА, конкурируют за связывающий участок на липополисахарид-связывающем белке (ЛСБ). В процессе взаимодействия образуются комплексы ЛСБ-ЛПС и ЛСБ-ДФПА R. sphaeroides. Эти комплексы затем конкурируют (на втором уровне) за участок на связанных с мембранами СД14, которые могут быть ассоциированы с трансмембранным белком S. Это приводит к образованию комплекса СД14-ЛПС и СД14 -ДФПА. Оба эти комплекса могут взаимодействовать с другим трансмембранным белком (возможно сигнальным) и вызывать димеризацию этих белков. Предполагают, что когда комплекс СД14-ЛПС ассоциирует с сигнальным белком (это может быть третий уровень конкурентного связывания) генерируется сильный сигнал, который инициирует активацию клеток. Этот сигнальный белок может быть одним из трех классов трансмембранных рецепторов, описанных ранее. Когда комплекс СД14-ДФПА R. sphaeroides ассоциирует с сигнальным белком генерируется только слабый сигнал, который не в состоянии активировать клетку. Однако, такие теоретические основы действия ДФПА R. spaeroides не могут быть подтверждены экспериментально до тех пор, пока не будет идентифицирован сигнальный белок. Эти исследования в настоящее время проводятся в ряде лабораторий. Результаты исследований дают теоретические предпосылки для использования ДФПА R. sphaeroides в сочетании с другими лекарственными препаратами для лечения септического шока, вызванного грамотрицательными бактериями. Литература |