МЕТОДИ ТОКСИКОЛОГІЧНОГО АНАЛІЗУ

УДК УДК 577.1:578.083:612.4.42

МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ ПРИЧЕТНОСТІ ОКСИДУ АЗОТУ ДО ЦИТОТОКСИЧНОЇ ДІЇ В УМОВАХ IN VITRO

М.П. Дмитренко, проф., С.Г. Шандренко, Л.М. Смердова

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, Київ, Україна

Чисельні дослідження ролі оксиду азоту (NOo) в життєзабезпечені і здійснені функції клітин або їх загибелі, виконані за допомогою непрямих методів визначення утворення NO, оскільки ця сполука є высокореакційним радикалом з часом життя всього біля 6-ти секунд і обмеженим радіусом дії [1, 2]. Тому звичайно використовують інгібітори і активатори NO-синтази, слідкують за утворенням нітро- та S- і N-нітрозосполук, метгемоглобіну, нітритів і нітратів, тощо [3-7]. Але непрямі методи не дають остаточної відповіді на те чим в кожному конкретному випадку обумовлена регуляторна або цитотоксична дія: безпосередньо NO, продуктами його метаболізму чи іншими причинами.

Відомий метод прямого визначення утворення NO в організмі полягає в тому, що тваринам вводять (шляхом ін'єкцій) розчини диетилдитіокарбомату натрію (ДТК) і солі двохвалентного заліза (Fe2+). Ці сполуки поєднуються в клітинах і тканинах організму, утворюючи комплекс ДТК-Fe2+, що здатний міцно зв'язувати NO з формуванням парамагнітного нітрозильного комплексу, сигнал якого реєструється за допомогою методу ЕПР-спектроскопії [8, 9]. В дослідах in vitro для прямого визначення утворення NO клітинами до них в культуральне середовище додають готовий комплекс ДТК-Fe2+, через деякий час суспензію клітин заморожують при температурі рідкого азоту і проводять ЕПР-спектроскопію [10]. Недоліком цього методу є те, що комплекс ДТК-Fe2+ є нерозчиним, що змушує використовувати його у великій кількості, часто токсичній для клітин. До цього ж він не проникає крізь плазматичну мембрану і тому може уловлювати NO тільки в позаклітинному середовищі, куди вивільнюється лише частина синтезованого NO. Решта NO утворює комплекси і вступає в реакції з клітинними сполуками та окислюється.

Згадані методи використовуються тільки для визначення інтенсивності синтезу NO. Крім того, метод ЕПР-спектроскопії доступен далеко не кожній дослідницькій лабораторії.

В цій роботі пропонується простий, чутливий і специфічний метод, який дає змогу визначати причетність NO до токсичної дії хімічних сполук на клітини в умовах in vitro. Цей метод також може бути корисним для дослідження ролі NO в тих чи інших регуляторних механізмах метаболізму і функції клітин.

Ефективність розробленого методу апробована при досліджені участі NO в цитотоксичній дії донорів оксиду азоту: нітропрусиду натрію (НПН), нітрогліцерину (НГ) і N-нітрозодиметиламіну (НДМА), що проведено на активованих перітонеальних макрофагах щура.

Матеріали та методи дослідження

В роботі використані реактиви: диетилдитіокарбамат натрію, сульфат заліза (ІІ) — FeSO4•7H2O, середовище RPMI 1640, фірми "Sigma" (США).

Досліди проводились на білих щурах-самцях, вагою 150-180 г. Для активації макрофагів тваринам інтраперитоніально вводили вакцину БЦЖ в дозі 1 мг на 100 г маси тіла. На 7-10 добу щурів декапітували под ефірним наркозом. Отримання перитоніальних клітин та виділення макрофагів здійснювали з використанням середовища RPMI 1640, забуференого Na2HCO3 до рН 7,3 [11]. Суспензію виділених макрофагів поділяють на дві частини, одна з яких слугує контролем, а другу інкубують 30 хв. при 37°С в середовищі RPMI 1640 з 0,1 мМ ДТК, центрифугують 3 хв. при 1000 об/хв., потім ресуспендують і інкубують 30 хв. при 37°С в середовищі RPMI 1640, що вміщує 0,1 мМ FeSO4•7H2O, та відмивають центрифугуванням і ресуспендують в середовищі RPMI 1640. В результаті такої обробки в мембранах макрофагів формується комплекс ДТК-Fe2+, здатний уловлювати і міцно утримувати NO у вигляді мононітрозильного комплексу заліза з ДТК, що проявляє парамагнітні властивості і реєструється методом ЕПР. Виміри сигналів ЕПР проводили в замороженій в рідкому азоті суспензії клітин на радіоспектрометрі "Varian E-109". Вказані концентрації ДТК та Fe2+ є найбільшими, при обробці якими клітин ще не спостерігається їх загибель протягом 6 годин інкубації.

Для порівняльного дослідження токсичної дії НП, НГ і НДМА на контрольні (інтактні) і вміщуючі пастку NO макрофаги, їх суспензії розливали паралельно в 24-луночні пластикові планшети, додавали по 75 ОД пеніциліну і стрептоміцину, 5 %-ну інактивовану сироватку теляти і вивчаємі сполуки в кінцевих, близьких за своєю цитотоксичністю концентраціях, що мали: НДМА — 0,014 мМ, НПН — 0,10 мМ, НГ — 0,25 мМ. Інкубували в СО2 — інкубаторі (5 % СО2) при 37°С. Через 6 годин інкубації визначали життєздатність клітин суправітальним тестуванням за допомогою профарбування трипановим синім. Кількість нітритів в середовищі інкубації клітин визначали за допомогою реактива Грису [12] модифікованим нами методом [13].

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistika.

Результати та їх обговорення

Принцип методу полягає в тому, що внесок NО в механізм цитотоксичної дії тієї чи іншої хімічної сполуки оцінюється через порівняння кількості загиблих клітин серед контрольних і вміщуючих в собі пастку NО (комплекс DTК-Fe2+). Цей комплекс вбудовується в клітини шляхом їх послідовної інкубації в культуральному середовищі з ДТК, який є гідрофобною сполукою і тому накопичується в ліпідному шарі мембран, а потім з сульфатом заліза (2+). Він здатен утворювати стійкий мононітрозильний комплекс з NО і тим самим блокувати його дію.

Для того, щоб підтвердити наявність і функціонування в мембранах макрофагів пастки NO, через суспензії макрофагів як контрольних, так і підданих обробці ДТК та Fe2+, пропускали газову суміш 1 % NO в N2. В результаті, за даними ЕПР-спектрометрії, в спектрі контрольного зразку спостерігався характерний асиметричний синглетний сигнал динітрозильного комплексу ендогенного негемового заліза з SH-вміщуючими білками RSH-Fe-NO (g=2,037). Цей сигнал був повністю відсутнім в спектрі оброблених макрофагів. Замість нього з'явився триплетний сигнал мононітрозильного комплексу ДТК-Fe-NO (рисунок).

Активовані перітонеальні макрофаги посилено синтезують NO, що можно спостерігати за накопиченням в середовищі інкубації клітин іонів NO2-. Концентрація нітритів в інкубаційному середовищі макрофагів з комплексом ДТК-Fe2+ зменшена майже в 5 разів на 6-у годину інкубації: в середовищі оброблених клітин вона становила 18,5 нмоль/107 кл., а необроблених — 90,5 нмоль/107 кл., що вказує на високу акцепторну ємність пастки по відношенню до NO.

Для визначення загальної кількості комплексу, утворенного в клітинах, останні обробляли розчином, що містив замість Fe2+ еквімолярну кількість Cu2+. Утворений при цьому комплекс ДТК-Cu2+ має парамагнітні властивості, які дозволяють по відповідному сигналу ЕПР розрахувати його концентрацію, а отже і комплексу ДТК-Fe2+. Вона становить 18 нмоль комплексу на 107 клітин. В перерахунку на одну клітину в середньому приходиться 109 молекул пастки. Присутність такої кількості пастки в макрофагах забезпечує акцепторну ємність щодо NO достатню для з'ясування участі цієї сполуки в механізмі цитотоксичної дії речовин в умовах in vitro та суттєво не впливає на виживаємість клітин в процесі інкубації (табл.). Останнє дає підставу припустити, що ендогений синтез nО не є ключовою ланкою в механізмі життєзабезпечення клітин.

Представлені в таблиці дані вказують на ефективність запропанованого методу. Зокрема, в умовах досліду наявність пастки NО в структурі макрофагів усуває цитотоксичну дію НПН майже повністю (на 86 %), а НГ в меньшій мірі (на 63 %). Різний по відношенню до цих сполук детоксикуючий вплив пастки NО, можливо, пов'язан з тим, що вона переважно локалізується в плазматичній мембрані макрофагів. Тому NО, що більшістю утворюється із НГ ферментативно в ендоплазматичному ретикулумі і мітохондріях [14], є меньш доступним для пастки, ніж NО, який вивільнюється з НПН у розчині і при контакті з плазматичною мембраною клітин [15]. Макрофаги з пасткою NО, під впливом НДMA гинуть навіть дещо в більшій кількості, ніж контрольні клітини (табл.). Звідси витікає, що токсичність НДMA не є результатом метаболічного денітрозування. Навпаки, можна припустити, що NO, яке утворюється з НДМА, і (або) синтезується макрофагами збільшує їх стійкість до цитотоксичної дії цієї N-нітрозосполуки.

Таким чином, результати даного експерименту підтверджують значимість і практичну цінність розробленої нами методики.

Література
1. Lincoln J., Hoyle C.H.V., Burnstock G. Nitric oxide in health and disease // Cambridge University Press, 1997. -363P.
2. Brune B., von Knethen A., Sandau K.B. Nitric oxide and its role in apoptosis// European Journal of Pharmacology. -1998. -351, N2. -P. 261-272.
3. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models// FASEB J. -1993. -7, N2. -P. 349-360.
4. Drapier J.C., Pellat C., Henry Y. Generation of EPR-detectable nitrosyl-iron complexes in tumor tardet cells cocultured with activated macrophages// J.Biol. Chem. -1991. -266, N16. -P. 10162-10167.
5. Kurt Schmidt, Peter Klatt, Bernd Mayer. Reaction of peroxynitrite with oxyhaemoglobin: interference with photometrical determination of nitric oxide// Biochem.J., 1994. N301, -P. 645-647.
6. Kosaka H., Wishnok J.S., Miwa M., et al. Nitrosation by stimulated macrophages. Inhibitors, enhancers and substrates//Carcinogenesis. -1989. -10, N3. -P. 563-566.
7. Samoilov A., Zweier J.L. Development of chemiluminescence-based methods for specific quantitation of nitrosylated thiols// Anal. Biochem. -1998. -258, N2. -P.322-330.
8. Ванин А.Ф., Манухина Е.Б., Лапшин А.В., Емерсон Ф.З. Усиление синтеза оксида азота при экспериментальном инфаркте миокарда // Бюлл. эксперим.биол. и медицины, 1993. №8, -C. 142-144.
9. Kotake Y., Tanigawa T., Tanigava M., Ueno I., Allen D.R., Lai C.S. Continuous monitoring of cellular nitric oxide generation by spin trapping with an iron-dithiocarbamate complex // Biochim. Biophys. Acta. -1996. -1289, N3. -P. 362-368.
10. Лимфоциты. Методы / Под ред. Дж.Клауса. -М: Мир, 1990. -401 с.
11. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J.G. Analysis of nitrate, nitrite and 15N-nitrate in biological fluids // Anal.Biochem. -1982. -126, N1. -P. 131-138.
12. Дмитренко Н.П., Сноз С.В., Шандренко С.Г. та інш. Влияние акцепторов оксида азота на критериально значащие биохимические показатели у крыс с нитритной нагрузкой.//Соврем. проблемы токсикологии, 1998. -№1. -C. 24-28.
13. Chung S-J., Fung H-L. A common enzyme may be responsible for the conversion of organic nitrates to nitric oxide in vascular microsomes // Biochim. Biophys. Res. Communs. -1992. -185, N3. -P.932-937. 14. Дмитренко Н.П., Кишко Т.О., Шандренко С.Г. О роли ксантиноксидазы в цитотоксическом действии нитратов и нитритов // Укр.біохім.журн. -2001. -73, №6. -С. 113-118.


| Зміст |