МЕХАНІЗМИ ІНТОКСИКАЦІЙ

УДК:616.341+615.916'546.815]:636.028

АПОПТОЗ ЕПІТЕЛІЮ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ТОНКОЇ КИШКИ ЩУРІВ ПРИ СВИНЦЕВІЙ ІНТОКСИКАЦІЇ

С.П. Луговський, к.м.н.

Український НДІ промислової медицини, м. Кривий Ріг

Загальновідомо, що апоптоз є суто фізіологічною реакцією, необхідною для підтримки тканинного гомеостазу і регуляції об'єму тканин [1-3]. З одного боку, в нормальних умовах апоптоз урівноважує процеси новоутворення клітин, а з другого, в умовах змін навколишнього і внутрішнього середовища організму може сприяти розвитку атрофії в окремих тканинах і навіть органах [3, 4]. Це, в першу чергу, відноситься до тканин, що швидко відновлюються, наприклад слизової оболонки (СО) тонкої кишки, яка окрім специфічних функцій всмоктування відіграє функцію захисного бар'єру при надходженні в організм ксенобіотиків, в тому числі важких металів.

Безперервне відновлення тканин (регенерація) представляє собою структурний еквівалент функцій організму. На клітинному рівні підтримка біологічної цілісності організму при відповідних змінах навколишнього і внутрішнього середовища реалізується за рахунок регуляторного впливу ефекторних сигналів, що підтримують складну рівновагу між інтегративними фізіологічними процесами: проліферацією, диференціровкою і фізіологічною загибеллю клітин (апоптозом) [4].

Відомо, що апоптоз дуже складний, тонко регульований активний процес, що потребує від клітини значних енергетичних затрат [2, 3, 5]. Встановлено, що його індукцію в деяких тканинах здатні ініціювати іони важких металів, таких як свинець, марганець, тощо [6, 7]. Добре відомо, що апоптозу належить ведуча роль в структурній перебудові слизової оболонки тонкої кишки при глютеіновій ентеропатії (інтоксикації глютеіном), але підсилюється апоптоз первинно, а потім стимулює проліферацію епітелію, чи навпаки, досі не ясно [2].

Одним з ведучих клінічних синдромів хронічної свинцевої інтоксикації є гастро-абдомінальний, який обумовлений специфічною дією цього токсиканту на систему органів травлення і морфологічно проявляється структурною перебудовою слизової оболонки тонкої кишки [8]. В зв'язку з цим, метою роботи було визначення інтенсивності відновлюючих (проліферативних) процесів та апоптозу в епітелії крипт слизової оболонки різних відділків тонкої кишки в динаміці експериментальної свинцевої інтоксикації.

Матеріали та методи дослідження

Дослідження були проведені на 2 серіях нелінійних білих щурів (по 24 в кожній), одна з яких була контролем. Тварин утримували на стандартному харчовому і питному режимах в умовах віварію. В кожній серії було 4 групи тварин, по 6 в кожній. Піддослідним тваринам протягом 21 дня (2 рази на тиждень) в асептичних умовах в черевну порожнину вводили водний розчин ацетату свинцю в дозі 125 мг/кг (в перерахунку на іон металу — 68,2 мг/кг). Контрольні щурі отримували ін'єкції фізіологічного розчину хлориду натрію. Евтaназію тварин проводили під гексеналовим наркозом (40 мг/кг) шляхом декапітації через 1, 5, 10 і 21 день. З черевної порожнини виділяли відрізки дванадцятипалої і порожньої кишки завдовжки до 1,0 см, розсікали в довжину і фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну. Після фіксації кожний шматочок кишки поділяли лезом бритви на 3 однакових і за загально прийнятою методикою готували парафінові блоки та гістологічні зрізі товщиною 5-10 мкм [9]. Гістологічні препарати фарбували гематоксиліном і еозином. Для електронно-мікроскопічного дослідження шматочки кишки розміром 1х1—1х2 мм фіксували в 4 % розчині глютарового альдегіду на 0,2 М кокоділатному буфері (рН — 7,2-7,4), з подальшою фіксацією в 1,33 % розчині чотирьохокису осмію на тому ж буфері, зневожували у спиртах та заключали у вестопал W (Sigma). Ультратонкі зрізи тонкої кишки готували після попереднього вивчення в світлооптичному мікроскопі напівтонких зрізів (1-2 мкм), що фарбували метиленовим синім, азуром ІІ та основним фуксином. Це дозволяло при виготовленні ультратонких зрізів за допомогою ультрамікротому фірми LKB (Швеція) орієнтувати тканинні блоки на базальні відділки СО тонкої кишки, де розташовані крипти. Ультраструктурні дослідження СО тонкої кишки щурів проводили за допомогою електронного мікроскопу JEМ 100 В (Японія) після фарбування ультратонких зрізів 1-2 % спиртовим розчином уранілацетату і контрастування їх цитратом свинцю по Рейнольдсу. За допомогою світлооптичного мікроскопу вивчали гістоструктуру СО тонкої кишки та проводили морфометрічні дослідження. Під масляним об'єктивом мікроскопу (х90) в 30 полях зору кожного гістологічного препарату підраховували кількість фігур мітозів та апоптозних тілець в криптах кишки. Мітотичний індекс (МІ) епітелію крипт та індекс апоптозу (ІА) розраховували (в %) на 1000 епітеліоцитів крипт слизової оболонки тонкої кишки. Крім цього, розраховували індекс відношення МІ/ІА. Всі отримані результати обробляли методами варіаційної статистики на ПК Р ІІІ за допомогою пакету прикладних програм EXСEL в середовищі WINDOWS, достовірність результатів оцінювали за коефіцієнтом Ст'юдента [10].

Результати та їх обговорення

Морфологічні дослідження дванадцітипалої та порожньої кишки тварин показали, що на ранніх строках експерименту (1-5 день) у них, на відміну від контролю, в слизовій оболонці 12-палої та порожньої кишки спостерігалось підвищене злущення епітеліоцитів на верхівках ворсин кишок, часткова гіпертрофія окремих бокаловидних клітин, набряк строми ворсин, а також потовщення надепітеліального шару слизу, що може розцінюватись як захисна реакція органу на дію хімічного подразника [11]. В середній третині кріпт, як правило зустрічались фігури мітозів та поодинокі апоптозні тільця (1-2 на 3-5 кріпт) у вигляді щільних, надто еозинофільних тілець в яких іноді розташовувались базофільні залишки ядерного матеріалу (рисунок а). На подальших строках свинцевої інтоксикації (10-21 день) вираженість морфологічних змін в значній мірі залежала від її тривалості, що обумовлено дозозалежним ефектом. У дослідних тварин мікроскопічно спостерігалось часткове зменшення розміру ворсин в СО кишки, виражений набряк їх строми та окремих епітеліоцитів, гіпертрофія і гіперплазія бокаловидних клітин, а також значне потовщення надепітеліального шару слизу, який імовірно, відіграє захисну роль, зв'язуючи надлишки свинцю в порожнині тонкої кишки, чим перешкоджає його подальшому всмоктуванню [11]. Візуально, на відміну від контролю, в криптах тонкої кишки тварин відмічалось значне збільшення кількості фігур мітозів і апоптозних тілець.

Електронно-мікроскопічні дослідження СО різних відділків тонкої кишки показали, що ультраструктурні зміни клітин, які вступали до апоптозу, характеризувались зменшенням їх об'єму до 50 мкм, зникненням з поверхні мікроворсинок; значним ущільненням цитоплазми клітин, за рахунок чого спостерігалась надто висока їх електронна щільність; присутністю в цитоплазмі клітин деструктивно змінених внутріклітинних органел, та надто вираженою конденсацією хроматину ядра. При цьому, в клітинах, які вступили до апоптозу, спостерігалась цілісність зовнішньої клітинної оболонки, що попереджувало вихід клітинного матеріалу в зовнішнє середовище і відповідно розвиток місцевої запальної реакції. Інколи у таких клітин реєструвались зміни їх поверхні у вигляді везикулярних виступів різного розміру. Як правило, ці зміни виявлялись лише у тих клітин, у яких відмічалась конденсація хроматину ядра (рисунок б). Клітини з характерними для апоптозу ультраструктурними змінами часто розташовувались поблизу базальної мембрани, через яку вони або їх подрібнені частки у вигляді окремих, невеличких апоптозних тілець проникали до підслизової оболонки тонкої кишки де відбувався їх фагоцитоз макрофагами. В таких випадках спостерігали структурні зміни базальної мембрани у вигляді її розшарування та потоншення (рисунок, б). Часто окремі апоптозні тільця можна було бачити в міжепітеліальному просторі крипт СО кишки, або безпосередньо в цитоплазмі сусідніх епітеліоцитів, що в данному випадку виконували функцію тканинних макрофагів. В фагоцитованих апоптозних тільцях часто спостерігались залишки деструктивно змінених внутріклітинних органел і ядра у вигляді їх окремих фрагментів з конденсованим, електроннощільним хроматином (рисунок, в). Активний процес утворення апоптозних тілець в криптах СО тонкої кишки при свинцевій інтоксикації обумовлював наявність в цитоплазмі епітеліальних клітин крипт численної кількості надто крупних фаголізосом (рисунок, г).

Різна інтенсивність вступу епітелію крипт СО тонкої кишки у апоптоз контрольних і дослідних щурів обумовлювала можливість детального спостереження всієї морфологічної динаміки процесу лише у дослідних щурів і особливо на пізніх (10-21 день) строках свинцевої інтоксикації.

Морфометричні дослідження виявили, що у контрольних щурів МІ епітелію крипт СО 12-палої кишки в окремих випадках коливався на рівні від 28 ‰ до 61 ‰ і в середньому в кожній групі на різних строках дорівнював від 45,5 ‰ до 47,3 ‰ без вірогідної різниці, що дало підставу для об'єднання показників МІ у щурів різних контрольних груп в одну групу контролю з середнім показником МІ на рівні 46,61±3,04 ‰. Таким самим чином був отриманий аналогічний контрольний показник для порожньої кишки, який в середньому становив 47,83±3,09 ‰. Кількісний показник ІА в криптах тонкої кишки був наближеним до 1,0 ‰, з невірогідною різницею між 12-палою і порожньою кишкою (таблиця).

Через 1 день після першої ін'єкції ацетату свинцю змінювались всі досліджені морфометричні показники епітеліального шару в криптах СО тонкої кишки в напрямку зниження МІ та відповідного збільшення ІА і ІА/МІ. При цьому, якщо в 12-палій кишці МІ не мав вірогідних змін по відношенню до контролю, то в порожній кишці він вірогідно знижувався майже на 17 %. Підвищення ІА в 12-палій і порожній кишці майже в 3 рази вказує на перевагу атрофічних процесів над гіперпластичними, що підтверджується збільшенням в 4 рази індексу ІА/МІ. На 5 день свинцевої інтоксикації МІ епітелію СО 12-и палої кишки вірогідно не відрізнявся від попереднього строку, а в порожній кишці він вірогідно знижувався на 21 % в порівнянні з контролем (таблиця). При цьому, якщо ІА в СО крипт 12-палої кишки збільшувався майже в 6 разів по відношенню до контролю, то в порожній кишці він збільшувався практично в 9 разів, що призводило до вірогідного підвищення індексу ІА/МІ відповідно в 7,5 та 12,5 рази.

На 10 день свинцевої інтоксикації спостерігалась деяка стабільність з боку показників МІ епітелію СО різних відділків тонкої кишки, що відбувалось, імовірно, за рахунок включення адаптаційних механізмів. В той же час, показник ІА в СО різних відділків тонкої кишки по відношенню до відповідних контролів збільшувався в середньому майже на порядок. За рахунок цього і показник ІА/МІ збільшувався відповідно в 10 разів в 12-палій та в 15 разів в порожній кишках. На 21 день свинцевої інтоксикації відбувалoсь вірогідне зменшення МІ епітелію крипт 12-палої кишки в порівнянні з контролем на 20 %, а в порожній кишці, на 29 % (P<0,01). Одночасно з цим збільшувалась кількість епітелію крипт СО різних відділків тонкої кишки, що вступала до апоптозу, перевищуючи контроль майже в 12 разів. Відповідно зростав і показник ІА/МІ в порівнянні з контролем. Так, в 12-палій кишці він збільшувався майже в 15 разів, а в порожній — в 19 разів.

Отримані данні вказують, імовірно, на різну чутливість епітелію СО різних відділів тонкої кишки до дії свинцю. Зокрема, більш чутливим є епітелій СО порожньої кишки. Неоднакова чутливість епітелію СО різних відділків тонкої кишки, імовірно, може бути пояснена особливостями метаболізму свинця в живому організмі, зокрема його всмоктуванням [12].

При прискореній загибелі клітин шляхом апоптозу під дією свинцю правомірно було б очікувати розвиток значних і виразливих атрофічних змін в СО тонкої кишки. Відсутність таких на гістологічних препаратах можна пояснити мозаїчністю загибелі клітин, асинхронністю початку апоптозу в різних клітинах та швидким їх виділенням з епітеліального шару СО шляхом екструзії і фагоцитозу [13, 14]. Крім цього, швидкість, з якою клітина проходить весь шлях апоптозу, компенсаторні механізми відновлення епітеліального шару, незважаючи на силу впливу (дозу свинцю), не дали змоги сформувати морфологічно виразливі атрофічні зміни в СО тонкої кишки дослідних щурів.

Відомо, що фізіологічна елімінація клітин з верхівок ворсин тонкої кишки обумовлена апоптозом [1]. Якщо апоптоз на верхівках ворсин обумовлений "визріванням" клітин і поступовою природною загибеллю їх, що забезпечує безперервну зміну ентероцитів, то в кріптах тонкої кишки апоптоз, імовірно, має зовсім інший біологічний зміст. Ті місця, де найбільш часто зустрічаються апоптозні тільця, співпадають з місцем, де стволові клітини проходять своє останнє запрограмоване ділення [1, 3]. Тобто, середня третина крипти тонкої кишки нагадує своєрідний "пропускний пункт". Якщо в клітинах за попередні клітинні цикли накопичилися пошкодження ДНК або мутації, що обумовлені генотоксичною дією свинцю, і їх не можливо полагодити, клітина гине шляхом апоптозу. Небезпечність, яку представляють для організму такі клітини з пошкодженим геномом, очевидна, можливо тому загибель клітин шляхом апоптозу часто називають в літературі "альтруїстичним суїцидом"[15]. Можливо, що таким чином апоптоз в кріптах тонкої кишки при свинцевій інтоксикації надто великими дозами виконує важливу біологічну роль, яка заключається в підтримці чистоти геному клітин, яким ще потрібно пройти шлях диференціровки в епітеліальному шарі СО.

Таким чином, встановлено, що ацетат свинцю в дозі 125 мг/кг при введенні щурам в черевну порожнину 2 рази на тиждень здатний ініціювати апоптоз епітелію крипт СО тонкої кишки. Інтенсивність, з якою епітеліоцити крипт СО різних відділків тонкої кишки вступають до апоптозу, має дозозалежний характер. Встановлено також, що існує різна чутливість епітелію СО дванадцятипалої і порожньої кишки до дії свинцю. Відсутність надто виражених морфологічних ознак атрофії СО тонкої кишки при свинцевій інтоксикації компенсується активною проліферацією епітелію крипт. Апоптоз епітелію крипт СО тонкої кишки щурів при інтоксикації свинцем в надто великих дозах носить, імовірно, захисний характер, направлений на підтримку чистоти геному активно проліферуючих клітин крипт СО тонкої кишки.

Література
1. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. —М:. Триада-Х, 1998. —496 с.
2. Аруин Л.И. Апоптоз при патологических процессах в органах пищеварения // Клин. медицина. —2000. —№1. —С. 5-10.
3. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций. Руководство / Под ред. Д.С. Саркисова —М.: Медицина, 1987. —448 с.
4. Программированная клеточная гибель. / Под ред. В.С. Новикова. —Спб.: Наука, 1996. —276 с.
5. Белушкина Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза // Арх. патологии. —2001. —№1. —С. 51-60.
6. Иммунофармакология микроэлементов. /Кудрин А.В., Скальный А.В., Жаворонков А.А., Скальная М.Г., Громова О.А. —М.: КМК, 2000. —537 с.
7. Zhavoronkov A.A., Lugovskoy S.P. Enterocyte apoptosis induced by manganese chloride // Trace Elements in Mtdicine. —1992. —Vol. 9. —P. 113- 116.
8. Любченко П.Н. Интоксикационные заболевания органов пищеварения. Воронеж: Из-во, 1990. —184 с.
9. Микроскопическая техника. Руководство. / Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова —М.: Медицина, 1996. —544 с.
10. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. —К.: МОРИОН, 2000. —320 с.
11. Морозов И.А., Лысиков Ю.А., Питран Б.В. Хвиля С.И. Всасывание и секреция в тонкой кишке: субмикроскопические аспекты. —М.: Медицина, 1988. —224 с.
12.Луговський С.П. Вплив мікроелементів заліза та цинку на всмоктування свинцю слизовою оболонкою різних відділів тонкої кишки щурів // Фізіолог. журн. —2001. —№2. —С. 41 —45.
13. Лушников Е.Ф., Загребин В.М. Апоптоз клеток: морфология, биологическая роль, механизмы развития // Арх. патологии. —1987. —№2. —С. 84-89.
14. Мурадян Х.К. Апоптоз и старение // Пробл. старения и долголетия. —1999. —№1. —С. 85-102.
15. Jacguelyn J., Gregory J.G. Apoptosis: silent killer or neutron Bomb? // Hepatology. —1998. —Vol. 28. —Р. 865 —867.


| Зміст |