УДК 545.224.4:591.3:616.007:615.099:622

О.П. Кравчук, к.м.н., І.В. Болтіна, О.Л. Костик, Д.С. Пігіда, Т.А. Бухтіарова, д.м.н., В.С. Хоменко, к.м.н., О.Є. Ядловський, к.б.н.

РЕЗУЛЬТАТИ ВИВЧЕННЯ МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ ПРЕПАРАТУ ПІРОДАЗОЛ

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя
Інститут фармакології та токсикології АМН України

Ненаркотичні аналгетики широко використовуються при лікуванні болі різного генезу [1—4]. Однак вони можуть мати побічну дію та не завжди забезпечують адекватне обезболювання. Тому пошук нових аналгетиків, які перевершують існуючі за ефективністю, є актуальною проблемою фармакології.

В процесі досліджень був визначений новий клас сполук — конденсовані імідазолвміщуючи гетероцикли з ключовим атомом азоту. Ці сполуки (гетероциклічні системи, сконденсовані з імідазолом) були вивчені в Інтситуті фармакології та токсикології АМН України.

Для поглибленного дослідження був обраний піродазол (Д-57), який являє собою гидробромід 1,2-ди (n-метоксифеніл) — 6,7-дігідро-5Р-пірроло-[1,2-а] імідазол.

Метою даних досліджень було вивчення мутагенної активності піродазолу.

При виконанні роботи були використані слідуючі методи: тест на індукцію генних мутацій у Salmonella typhimurium (тест Еймса) та тест на індукцію аберацій хромосом лімфоцитів периферійної крові людини in vitro без та з метаболічною активацією.

Матеріали та методи дослідження

Лімфоцити культивували загальноприйнятим методом Хангерфорда протягом 52 год [5] з модифікациями (ПА № 4301), що дозволяло досліджувати клітини, які знаходились у першому мітозі. В експерименті використовували культуру лімфоцитів, отриману від донора — жінкі 35 років практично здорової, яка не застосовувала медичних препаратів та не мала на протязі 1 року рентгенологічних досліджень. Відбір метафазних платівок для цитогенетичного аналізу, класифікація та метод обліку аберацій хромосом були загальноприйнятими [6, 7] Для цитогенетичного аналізу використовували метафазні пластинки без перехрещень хромосом, які містили 46±2 хромосоми. Враховували аберації хроматидного та хромосомного типу. До аберацій хроматидного типу відносили поодинокі фрагменти (хроматидні делеції) та міжхроматидні обміни. Пробіли відмічали, але до числа аберацій не включали. Абераціями хромосомного типу вважали: парні фрагменти (термінальні делеції), кільцеві хромосоми, ацентричні кільця та дицентричні хромосоми. Проводили аналіз зашифрованих препаратів, забарвлених рутинним методом. В кожній концентрації аналізували не менше 100 метафаз. Статистичну обробку проводили згідно з критерієм Стьюдента.

Результати та їх обговорення

Дослідження цитотоксичності препарату піродазол

Спочатку визначали цитотоксичні концентрації піродазолу. Показником цитотоксичності препарату вважали зменшення мітотичного індексу в культурі лімфоцитів, що відповідає зниженню мітотичної активності лімфоцитів (табл. 1).

Як видно з приведених даних, при дії піродазолу в концентраціях 10000, 1000 та 100 мкг/мл було відмічено вірогідне зниження мітотичної активності лімфоцитів — цитотоксичний ефект. Тому мутагенні властивості препарату визначали в концентраціях, які були нижче токсичних: 10, 1, 0,1, 0,01 та 0,001 мкг піродазолу/1 мл розчину.

Експеримент без метаболічної активації

Визначали частоту метафаз з абераціями та спектр аберацій хромосом в культурі лімфоцитів периферійної крові людини при дії препарату піродазол з та без метаболічної активації (табл. 2).

Як видно з приведених даних, статистично вірогідне підвищення частоти аберацій хромосом порівняно зі спонтанною частотою аберацій (негативні контролі) було відмічено лише при дії піродазолу в концентрації 10 мкг/мл в експерименті без метаболічної активації. Але у порівнянні з частотою аберацій, індукованою диметилсульфоксидом, це підвищення не було достовірним (диметилсульфоксид і в дослідних варіантах експерименту з концентраціями піродазолу 10 мкг/мл, і в контролях диметилсульфоксиду вносили до культури лімфоцитів в однакових кількостях — по 2 мг). В інших варіантах експерименту з та без метаболічної активації піродазол не індукував статистично достовірного підвищення частоти аберацій хромосом — порівняно зі спонтанною частотою аберацій (негативний контроль та контроль S-9). Також не було відмічено вірогідного підвищення частоти аберацій хромосом і в контролях диметилсульфоксиду. Це свідчить про відсутність мутагенних властивостей у досліджуваних речовин. В той же час при дії на культуру лімфоцитів класичних мутагенів мітоміцину-С та циклофосфану, які використовували в позитивних контрольних варіантах експерименту, відмічено статистично достовірне підвищення частоти аберацій хромосом порівняно зі спонтанною частотою аберацій, що підтверджує адекватність застосування даної тест-системи для дослідження цитогенетичної активності хімічних речовин.

Аберації хромосом представлені поодинокими, парними фрагментами та обмінами. І хоча спектр зміщено в сторону аберацій хроматидного типу, але перевага фрагментів (одиночних та парних) також може бути пояснена дією чинників хімічної природи [8, 9].

Препарат піродазол не проявляє цитогенетичної активності в тесті на індукцію аберацій хромосом в культурі лімфоцитів періферійної крові людини in vitro без та з метаболічною активацією.

Дослідження мутагенної активності Піродазолу в тесті на індукцію генних мутацій у S. typhimurium (тест Еймса)

Матеріали та методи
Суть методу полягає в реєстрації здатності речовини, яка досліджується, та/або її метаболітів індукувати реверс-мутації від ауксотрофності до прототрофності за гістидином у тестерних штамів S. thyphimurium, які несуть his-мутації і не здатні синтезувати гістидин. Для утворення можливих метаболітів досліджувану речовину піддають процесу біотрансформації за допомогою ферментів мікросомального окислення, які містяться у постмітохондріальному супернатанті гомогенату печінки щурів — фракції S-9. Для цього бактерії S. thyphimurium інкубують разом із речовиною, яка досліджується, а також мікросомальною активуючою сумішшю — S-9 mix (фракція S-9 + Ко-фактори: НАДФ та глюкозо-6-фосфат).

Експеримент проводили у двох паралельних варіантах — без метаболічної активації та з активацією (мікросомальною активуючою сумішшю S-9 mix). У варіантах без метаболічної активації (без S-9 mix) реєстрували дію прямих мутагенів — тобто сполук, які індукують мутації за рахунок активності первинної структури досліджуваної речовини. Дію ж промутагенів, тобто сполук, ефект яких пов`язаний з утворенням мутагенних метаболітів, реєструють у варіантах експерименту з активацією.

Підготовка експерименту
З метою виявлення різних типів мутацій в експерименті використовували два тестерних штами S. typhimurium: ТА-98 (his D 3052, rfa, Duvr b, +R), які реєструють мутації за типом зміщення рамки зчитування, і ТА-100 (his G 46, rfa, Duvr b, +R), який реєструє мутації за типом заміни пар основ. Наявність мутагенного ефекту враховували за індукцією зворотних мутацій від ауксотрофності до прототрофності за гістидином. Відповідність кожного бактеріального штаму власному генотипу та характерний спонтанний рівень реверс-мутацій визначали за методикою [10]. Мікросомальну фракцію гомогенату печінки щурів готували за [10].

Необхідні для проведення експерименту обладнання, посуд, реактиви, поживні середовища та робота з бактеріальними культурами відповідали методичним вказівкам [11—13].

Вміст білку (визначали за методом [14]) в мікросомальній фракції складав 20,6 мг/мл.

Проведення експерименту
Спочатку визначали токсичні концентрації піродазолу на штамі S. typhimurium ТА-100 без метаболічної активації. (табл. 3)

Як видно з приведених даних, піродазол спричиняв статистично достовірну токсичну дію на бактерії тестерного штаму ТА-100 тільки в концентрації 1000 мкг/чашку. В інших концентраціях бактеріотоксичного ефекту відмічено не було.

Експеримент на дослідження мутагенної активності піродазолу проводили у двох паралельних варіантах: без метаболічної активації та з активацією мікросомальною активуючою сумішшю S-9 mix, які супроводжували негативними й позитивними контрольними варіантами та контролями диметилсульфоксиду (табл. 4).

Як видно з приведених у табл. 3, 4 даних, піродазол у концентраціях від 0,8 до 500 мкг/чашку в експериментах з та без метаболічної активації не індукував статистично достовірного підвищення кількості ревертантних колоній S. typhimurium тестерних штамів ТА-98 і ТА-100 у порівнянні зі спонтанними рівнями реверсій (негативні контролі). Також не було відмічено статистично вірогідного підвищення кількості ревертантних колоній і в контролях диметилсульфоксиду. Це свідчить про відсутність мутагенних властивостей у досліджуваних речовин. В той же час при використанні класичних мутагенів (позитивні контролі) було отримано статистично достовірне підвищення кількості ревертантних колоній у порівнянні із спонтанними рівнями реверсій, що вказує на адекватність використання даної тест-системи для дослідження мутагенних властивостей хімічних речовин.

Висновок

В тесті Еймса Salmonella/мікросоми при дії піродазолу на тестерні штами S. typhimurium ТА-98 і ТА-100 в експериментах з та без метаболічної активації мутагенної активності препарату не встановлено.

Література
1. Дзяк Г.В. Нестероидные противовоспалительные препараты: новые представления о механизме действия и новые возможности // Лікування та діагностика. —1998. —Т. 7, №3. —C. 12—16.
2. Насонов Е.Л., Лебедев О.В. Нестероидные противовоспалительные препараты: механизм действия и клиническое применение в ревматологии // Новости фармации и медицины. —1996. —Т. 30, №1. —С. 3—8.
3. Migrain // WHO Drug Inf. —1994. —V. 8, №4. —P. 218—219.
4. Wilcke I.R., Crisman M.V., Scarat W.K., Sams R.A. Pharmacokinetics of ketoprofen in healthy foals less than twenty-four Hours old // Am. J. Vet. Res. —1998. —V. 59, №3. —P. 290—292.
5. Hungerford D.A. Leucocytes cultured from small inocula of whole blood and preparation methaphase chromosomes by treatment with hypotic KCl // Stain Techn. —1965. —V. 40. —P. 333—338.
6. Evans.H.J Human perypheral blood lymphocytes for the analysis of chromosome aberrations in mutagen test. // Handbook of mutagenicity test procedurs, second edition. Elsever Sci. Pub., 1984. —P. 405—427.
7. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П.и др. Хромосомы человека.: Атлас. —М.: Медицина, 1982. —264 с.
8. Братівник Л.І. Оцінка мутагенної активності регуляторів росту рослин в культурі лімфоцитів людини // Тези доповіді ІІ з"їзду медичних генетиків України —Львів, 1995. —С. 24.
9. Пилинская М.А. Частота аберраций хромосом у работников теплиц и чувствительность их лимфоцитов in vitro к цитогенетическому действию диматифа // Цитология и генетика. —1985. —Т. 19, №2. —С. 124—128.
10. Maron D.M., Ames B.N., Revised metods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. —1983. —113. —P. 173—215.
11. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений. Итоги науки и техники. Токсикология. // М., 1986. —Т. 14. —С. 27—57.
12. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. / Методические указания. М., 1985.
13. Ames B.N., McCann Y., Yamasaki E. Methods for detection Carcinogens s Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome mutagenicity test. // Mut. Res. —1975. —V. 31. —P. 347—364.
14. Lowry O.N., Roserbrough N.J., Fart A.L. and Randal R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. —1951 —V. 193. —P. 265—275.