УДК 57.08+61-07[:31:681.31]

Бабич П.Н., Чубенко А.В., Лапач С.Н., Жминько П.Г.

ВЫЧИСЛЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА КУМУЛЯЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОВРЕМЕННЫХ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины,
Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя

При оценке токсических свойств промышленных химических веществ, так и фармакологических субстанций важным является изучение их кумулятивного действия. Исследование кумулятивных свойств необходимо для выяснения возможности накопления самого вещества в организме или вредных эффектов, возникающих при взаимодействии ксенобиотика и рецепторов, и прогнозирования хронических интоксикаций.

Понятие о кумуляции, типы кумулятивных эффектов, зависимость степени кумуляции от дозы и времени воздействия химических веществ, критерии опасности и методы исследований обобщены в ряде монографий и руководств [12, 16—18]. В соответствии с классической теорией кумуляции при повторном поступлении вещества в организм различают 2 типа первичного кумулятивного эффекта, определяемого по взаимодействию его с тканью организма: прочное или необратимое связывание с рецепторами, ферментами и др. (при этом нарушение функции наступает постепенно, по мере накопления вещества) и кратковременное взаимодействие вещества с биополимером (после взаимодействия вещество покидает рецепторное поле, но функция его остается еще некоторое время нарушенной). В первом случае речь идет о материальной, во втором — о функциональной кумуляции.

Выделяют еще и третий тип кумулятивного эффекта [17] — смешанный, который характеризуется тем, что хотя само вещество отсутствует на рецепторном поле, но с белковыми молекулами остаются надолго связаны его части молекулы, что впоследствии ведет к нарушению функции.

В литературе описано много методов изучения кумулятивного действия веществ, различающихся по уровню используемых доз, кратности введения и пути поступления. Следует отметить, что для более точного определения опасности кумулятивного действия веществ целесообразно проводить исследования на двух видах животных. При планировании эксперимента необходимо также учитывать назначение вещества, условия его применения, основной путь поступления в организм, режим воздействия и т.п. Поскольку кумулятивный эффект зависит от дозы и времени воздействия, то для сопоставления кумулятивного эффекта ряда соединений или различных химических групп веществ необходимо пользоваться одним из выбранных методов.

Кумулятивное действие биологически активного вещества обычно оценивается посредством коэффициента кумуляции, который рассчитывается по определенным формулам с предварительным использованием громоздких расчетов.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось обеспечить исследователей современными программами для быстрого вычисления коэффициента кумуляции.

Предложено много способов определения коэффициента кумуляции [3, 7, 17]. Мы остановимся в качестве примера на широко известном подходе, рассмотренном [7]. Этот же подход используется при расчете коэффициента кумуляции во всемирно известном программном средстве Statistica [10], производства компании StatSoft. В данном случае животным 5—7 раз в неделю вводят исследуемый препарат в дозе равной десятой части LD₅₀. Каждую неделю дозу увеличивают в полтора — два раза, отмечая при этом летальность животных. Результаты испытаний заносят в таблицу, аналогичную таблице 1 в [1]. В колонку 2 помещают суммарную дозу, которую получили животные за время опыта. В колонку 3 заносят количество погибших от этой дозы животных, которое включают также животных, погибших от меньших доз, так как они обязательно погибли бы и от этой дозы, а в колонку 4 — общее количество животных в группе. В колонку 5 заносят величину эффекта действия исследуемого вещества в пробитах, а в колонку 6 — весовые коэффициенты соответствующих пробитов. Данные для колонок 5 и 6 берут из таблиц 5 и 6 в [1].

Показатели токсичности при многократном введении исследуемого вещества (LDⁿ₁₆, LDⁿ₈₄, LDⁿ₅₀), рассчитывают на основе данных, занесенных в таблицу, и используя формулы (1)—(4) в [1]. Далее, учитывая научные данные и основываясь на показателях острой токсичности исследуемого вещества при его однократном введении (LD¹₁₆, LD¹₈₄, LD¹₅₀) рассчитывают коэффициент кумуляции K_кум по формуле:

   (1),

где s₁ — функция наклона прямой при однократном введении* и s_n — функция наклона прямой при многократном введении вычисляются по формулам:

   (2),

   (3)

Для примера рассмотрим данные, полученные в результате изучения действия препарата ЛК-37 на крыс при хроническом введении** (табл. 1). Данная таблица имеет некоторые особенности по сравнению с таблицей, которая использовалась для расчета LD₅₀. Так в столбце предназначенном для доз представлены суммарные дозы, полученные животными за время проведения опытов. В течение первых 7 дней им вводили по 80 мг/кг ежедневно (это приблизительно соответствует 1/10 LD₅₀ вычисленной при однократном введении). На следующей неделе ежедневная доза была увеличена в полтора раза и составила 120 мг/кг.

Рассчитаем коэффициент кумуляции K_кум на основании исходных данных посредством подпрограммы Cumulate_Calc, реализованной на VBA, которая позволяет значительно ускорить все расчеты и освобождает пользователя от рутинной работы. Текст данной программы приведен совместно с текстом программ предназначенных для расчета LD₅₀ в [1]. Кроме того, как следует из выражения (1), для расчета коэффициента кумуляции нам также понадобятся вычисленные в предыдущем примере LD₅₀, LD₁₆, LD₈₄. Общий вид исходных данных и их структурное расположение на рабочем листе Excel, которое необходимо для работы подпрограммы Cumulate_Calc, приведено на рис. 1.

Для запуска подпрограммы в меню последовательно выбираем "Сервис", "Макрос" (для Excel-97 и выше еще и "Макросы"). В появившемся окне выбираем макрос Cumulate_Calc (рис. 2).

После этого в последовательно появляющихся окнах вводим ссылки на необходимые для программы диапазоны ячеек, содержащих требуемые данные. Сначала вводится ссылка на диапазон ячеек, в которых содержатся рассчитанные ранее для однократного введения величины LD₅₀, LD₁₆, LD₈₄ (рис. 3). Для этого достаточно выделить посредством манипулятора "мышь" требуемый диапазон ячеек на рабочем листе или ввести его посредством клавиатуры.

Далее необходимо ввести в ответ на выдаваемые программой приглашения следующие ссылки:
— на диапазон ячеек с накопленными дозами (рис. 4);
— на диапазон ячеек с количествами животных, у которых обнаружен эффект (рис. 5);
— на диапазон ячеек с общими количествами животных в группах (рис. 6);
— на ячейку (требуется указать только одну ячейку, а не диапазон!) начиная с которой будут выводится результаты работы программы (рис. 7).

Далее подпрограмма рассчитает коэффициент кумуляции и сопутствующие ему показатели. Результаты работы программы приведены на рис. 8, где ld50(1), ld16(1), ld84(1) — соответствующие летальные дозы при однократном введении; ld50(n), ld16(n), ld84(n) — соответствующие летальные дозы при хроническом введении; k_кум — коэффициент кумуляции.

Считается, что чем больше единицы величина коэффициента кумуляции, тем более выражены кумулятивные свойства исследуемых биологически активных веществ. В случае, если вычисленный по формуле (3) K_кум<1, то это указывает на развитие привыкания. В нашем случае K_кум=1,0248, что свидетельствует о слабо выраженных кумулятивных свойствах данного вещества.

Еще одним подходом, применяемым для оценки коэффициента кумуляции, который широко используется в практике фармакологов и токсикологов, является метод, разработанный Ю.С. Каганом и В.В. Станкевичем (1964). Согласно этому методу коэффициент кумуляции K_кум вычисляют по следующей формуле

   (4),

где EDⁿ₅₀ — суммарная среднеэффективная (летальная) доза в подостром эксперименте при введении испытываемого биологически активного вещества равными дозами с суточным интервалом; ED¹₅₀ — эффективная (летальная) доза при однократном введении. Для достижения результата достаточно в течение двух месяцев испытать три дозы, которые составляют 1/5, 1/10 и 1/20 ED₅₀. В случае, если будет зарегистрирован хотя бы один смертельный случай, то коэффициент кумуляции следует рассчитывать по формуле:

   (5)

При расчете коэффициента кумуляции согласно выражению (4) или (5) согласно классификации Л.И. Медведя и соавторов (1968), на его основе можно сделать следующие выводы:
— если K_кум<1, то это свидетельствует о сверхкумуляции;
— если K_кум=1...3 — означает наличие выраженной кумуляции;
— если K_кум=3...5 — наблюдается умеренная кумуляция;
— если K_кум>5 — кумулятивные свойства вещества слабо выражены.

Минимальное количество информации о кумулятивных свойствах биологически активных веществ можно получить при проведении острых опытов путем определения индекса кумуляции, вычисляемого по формуле:

   (6),

где LD¹₅₀ — среднесмертельная доза, рассчитанная по результатам гибели животных в течение первых суток после введения испытуемого вещества; LD¹⁴₅₀ — среднесмертельная доза, рассчитанная по результатам гибели животных в течение 14 суток наблюдения за ними после однократного введения испытываемого вещества. Считается, что если LD¹₅₀ и LD¹⁴₅₀ равны (тогда I_кум=0) то эффект кумуляции является невыраженным. По мере приближения I_кум к 1 (то есть чем позже происходит гибель животных), тем более вероятно наличие у испытываемого вещества кумулятивных свойств.

Рассмотрим на примере Пликтрана*** расчет коэффициента кумуляции с использованием формулы (5). Исходные данные для расчета показателей летальности LD¹₅₀, LD¹₁₆, LD¹₈₄ при его однократном введении приведены в табл. 2.

Для расчета показателей LD¹₅₀, LD¹₁₆, LD¹⁸⁴ воспользуемся подпрограммой Accute_LD50_Calc, работа с которой была описана ранее. Вид исходных данных на рабочем листе приведен на рис. 9.

Для запуска подпрограммы в меню последовательно выбираем "Сервис", "Макрос" (для Excel-97 и выше еще и "Макросы"). В появившемся диалоговом окне выбираем макрос Accute_LD50_Calc [1]. Далее необходимо вводить в поля ввода появляющихся диалоговых окон ссылки на запрашиваемые диапазоны ячеек [1]. Результаты расчета LD¹₅₀, LD¹₁₆, LD¹₈₄ приведены на рис. 10, где ld¹₅₀ — это ld50, ld¹₁₆ — ld16, ld¹₈₄ — ld84.

Для оценки кумулятивного эффекта Пликтрана был поставлен подострый опыт на 10 животных, при проведении которого им ежедневно вводилось 1/10 LD¹₅₀ (50 мг/кг). Результаты приведены в табл. 3.

Рассчитаем коэффициент кумуляции K_кум согласно выражению (5) на основании исходных данных (табл. 3) посредством подпрограммы Cumulate_Calc2. Текст данной подпрограммы приведен совместно с текстом программ, предназначенных для расчета LD₅₀. Задействуем также необходимые для расчета коэффициента кумуляции вычисленные значения LD¹₅₀, LD¹₁₆, LD¹₈₄. Общий вид исходных данных и их структурное расположение на рабочем листе Excel, которое необходимо для работы подпрограммы Cumulate_Calc2, приведено на рис. 11.

Для запуска подпрограммы в меню последовательно выбираем "Сервис", "Макрос" (для Excel-97 и выше еще и "Макросы"). В появившемся окне выбираем макрос Cumulate_Calc2 и нажимаем на кнопку Выполнить (рис. 12).

Далее необходимо ввести в ответ на выдаваемые программой приглашения следующие ссылки:
— на ячейку, содержащую ранее рассчитанное значение LD¹₅₀;
— на диапазон ячеек с накопленными дозами;
— на диапазон ячеек с количествами животных, у которых обнаружен эффект;
— на диапазон ячеек с общими количествами животных в группах;
— на ячейку (требуется указать только одну ячейку, а не диапазон!!!) начиная с которой будут выводится результаты работы программы.

Вид диалоговых окон с запросами и полями ввода будут аналогичны приведенным на рис. 3—7.

Результаты расчета коэффициента кумуляции, выполненные на основе формулы (9.21) посредством подпрограммы Cumulate_Calc2, приведены на рис. 13—14, где ld50(1) — однократная среднесмертельная доза; ld50(n), ld16(n), ld84(n) — соответствующие летальные дозы при хроническом введении; k_кум — рассчитанный коэффициент кумуляции. Рассчитанное значение коэффициента кумуляции (0,4908) указывает на сверхкумулятивные характеристики Пликтрана.

______________________________

* — формула вычисления функции наклона прямой была предложена Литчфильдом и Уилкоксоном

** — статистические расчеты, используемые в фармакологии и токсикологии (методы альтернативного анализа)
(http://www.statsoft.ru/home/portal/applications/medicine/pharma.htm)

*** — Пликтран — Трициклогексилоловогидроксид

Литература
1. Бабич П.Н., Чубенко А.В., Лапач С.Н. Применение пробит-анализа в токсикологии и фармакологии с использованием программы MS Excel для учета фармакологической активности при альтернативной форме учета реакций // Современные проблемы токсикологии. —№4. —2003. —С. 81—89.
2. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. —2-е изд. перераб. и доп. —Л.: Медгиз, 1963. —152 с.
3. Иванов Ю.И. Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. —М.: Медицина 1990. —224 с.
4. В.Б. Прозоровский Использование метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности // Фармакол. и токсиколог. —№1. —1962. —С. 115-119.
5. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. —М., 1976. —324 с.
6. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., Маевский Е.И. Статистическая обработка результатов клинических испытаний // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. —М.: ЗАО ИИА Ремедиум, 2000. —С. 360—398.
7. Шефтель В.О., Дышиневич Н.Е., Сова Р.Е. Токсикология полимерных материалов. —К.: Здоровья, 1988. —212 с.
8. Evaluation of Drug Activities: Pharmacometrics / Ed. by D.R.Laurence, A.L.Bacharach. —London and New York: Academic Press, 1964. —Vol. 1. —456 c.
9. Ю.С. Каган. Общая токсикология пестицидов. —К.: Здоров'я, 1981. —176 с.
10. Статистические расчеты, используемые в фармакологии и токсикологии (методы альтернативного анализа).
—(http://www.statsoft.ru/home/portal/applications/medicine/pharma.htm).
11. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. —М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. —256 с.
12. Трахтенберг І.М., Кокшарьова Н.В., Шушуріна Н.О. Вивчення кумулятивних властивостей лікарських засобів при доклінічних дослідженнях // Доклінічні дослідження лікарських засобів: Методічні рекомендації / За ред. Стефанова О.В. —К.: Вид. дім "Авіцена", 2001. —С. 98—100.
13. Каган Ю.С., Станкевич В.В. Коэффициент кумуляции как количественный критерий // Сб. научн. трудов Актуальные вопросы гигиены труда, промышленной токсикологии и профессиональной патологии в нефтяной и нефтехимической промышленности. —Уфа, 1964. —С. 48—49.
14. Штабский Б.М., Каган Ю.С. К оценке кумулятивных свойств химических веществ по индексу и стандартизованном коэффициенту кумуляции. —Гигиена и санитария. —№3. —1974. —С. 65-67.
15. Бессмертный Б.С. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине. —М.: Медицина, 1967. —304 с.
16. Голубев А.А., Люблина Е.И., Толоконцев Н.А., Филов В.А. Количественная токсикология. —М.: Медицина, 1973. —287 с.
17. Каган Ю.С. Токсикология фосфорорганических пестицидов. —М.:Медицина, 1977. —298 с.
18. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду / Под общ. ред. А.А. Каспарова и И.В. Саноцкого. —Центр международных проектов ГКНТ. —М.: Внешторгиздат, 1986. —428 с.