ТОКСИЧНОСТЬ СВИНЦА И ВЛИЯНИЕ ЕГО НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, г. Киев

Загрязнение окружающей среды, вызываемые тяжёлыми металлами стоков промышленных предприятий, является одной из наиболее актуальных проблем последнего десятилетия. Основными источниками загрязнения сточных вод являются предприятия горной промышленности и металлургии, электроники и нефтедобычи, при этом концентрация Pb²⁺ в сточных водах достигает достаточно высокого уровня — 73—610 мг/л [1, 3], что значительно превышает предельно допустимые уровни этого иона. Свинец влияет на центральную нервную систему, вызывая неврологические повреждения у людей, особенно у детей, которые являются наиболее восприимчивыми к его действию. Наличие свинца в организме человека также вызывает изменения давления крови и нарушает репродукцию организма [8, 9].

В связи с высокой токсичностью этого элемента возрос интерес к проблеме устойчивости живых организмов, в том числе и микроорганизмов. Свинец в достаточно больших количествах могут аккумулировать бактерии и микромицеты [8, 10]. Дрожжи также способны аккумулировать свинец и большие количества его могут выводиться, локализуясь на клеточной стенке. Аккумуляция Pb²⁺ изучена более подробно только для дрожжей родов Saccharomyces и Candida [5, 6, 9].

Целью настоящей работы является сравнительная оценка токсичности Pb²⁺ к исследуемым штаммам дрожжей при различных концентрациях его в среде, а также изучение влияния ионов свинца на физиологию роста дрожжей.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили 7 видов дрожжей, выделенных из различных экологических ниш — телеоморфы аскомицетных дрожжей Williopsis californica (Lodder) von Arx (1977) УКМ-248 и Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hancen (1883) УКМ-1968, анаморфы аскомицетных дрожжей Candida krusei (Castellani) Berkhout (1923) УКМ-61t, анаморфы базидиомицетных дрожжей Rhodotorula mucilaginosa (Jorgensen) F.C. Harrison (1928) УКМ-1776, Rhodotorula aurantiaca (Saito) Lodder (1934) УКМ-1195, Rhodotorula F.C. Harrison sp. 4, Cryptococcus Vuillenium sp. WT. Данные культуры дрожжей были любезно предоставлены нам отделом физиологии промышленных микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины.

Биомассу дрожжей выращивали на среде Ридер следующего состава (г/л): (NH₄)₂SO₄ — 3,0, K₂HPO₄ — 0,1, KH₂PO₄ — 1,0, MgSO₄ — 0,7, NaCl — 0,5, глюкоза — 1%, дрожжевой экстракт — 0,1%; рН — 4,9.

Для оценки устойчивости исследуемых штаммов дрожжей в среду вышеуказанного состава добавляли соль Pb(NO₃)₂ в количестве 10, 50, 100, 200, 500, 750 мг/л Pb²⁺. Инокуляцию среды проводили суточной культурой исследуемых штаммов в концентрации 10⁷ кл./мл. Рост оценивали после 4-х суток культивирования в пробирках, содержащих 9,9 мл среды с определённой концентрацией металла и 0,1 мл инокулята при 28°C на качалках (240 об./мин). Критерием устойчивости дрожжевых культур к содержанию свинца в питательной среде служил прирост биомассы этих культур в сравнении с контрольным вариантом.

Изучение влияния ионов свинца на физиологию роста дрожжевых культур проводили на среде Ридер без металла (контроль) и с добавлением 50 мг/л Pb²⁺ в среду при периодическом культивировании на протяжении 96 часов. Рост культур оценивали через 6, 18, 24, 48, 72, 96 ч культивирования. Прирост биомассы измеряли на фотоэлектроколориметре (ЛМФ-69) в пересчёте на абсолютно сухой вес. рН среды определяли на рН-метре рН-150МА. Проводилась статистическая обработка данных.

Результаты и их обсуждение

Характер влияния на микроорганизмы тяжёлых металлов определяется, как известно, их концентрацией в среде, уровнем токсичности и биологическими свойствами микробных клеток [1]. В таблице представлены данные относительно роста дрожжей при различных концентрациях ионов pb²⁺ в среде Ридер. При изучении устойчивости дрожжей r. mucilaginosa УКМ-1776, r. aurantiaca УКМ-1195, rhodotorula sp. 4, w. californica УКМ-248, c. krusei УКМ-61t, s. cerevisiae УКМ-1968, cryptococcus sp. wt к различным концентрациям свинца показано, что наиболее устойчивыми штаммами были пигментированные штаммы r. mucilaginosa УКМ-1776 и cryptococcus sp. wt. Они способны расти при концентрации свинца в среде до 750 мг/л, при этом количество биомассы составило 0,96 и 0,76 г/л АСВ соответственно. В работе [4] показано, что в жидкой среде при наличии в среде культивирования значительных концентраций металлов, таких как медь и свинец, у дрожжеподобных клеток aureobasidium pullulans индуцируется появление меланинового пигмента. Меланиновый пигмент имеет высокую биосорбционную способность и его наличие в клетке обеспечивает её устойчивость к значительным концентрациям токсичных металлов [4], что и характерно для штамма cryptococcus sp. wt. Наименее устойчивым к значительным концентрациям свинца в среде был штамм s. cerevisiae УКМ-1968, при концентрации pb²⁺ в среде 200 мг/л накопление биомассы снижалось в 2 раза, а концентрации 500 и 750 мг/л были для него сильно токсичными. Все пигментированные штаммы дрожжей рода rhodotorula и темно-окрашенный штамм cryptococcus sp. wt при концентрации 200 мг/л иона свинца в среде и выше теряли способность к синтезу пигмента.

Известно, что устойчивость как грибов, так и дрожжей к токсическому действию тяжёлых металлов, а именно свинца, зависит как от морфологических, так и от физиологических характеристик клетки [2, 4]. Для последующих экспериментов была выбрана концентрация иона свинца 50 мг/л, так как она является минимальной концентрацией, при которой начинает проявляться эффект токсичности. На основании данных периодического культивирования (96 ч роста) установлено влияние иона свинца на изменения физиологии роста исследуемых штаммов (рис. 1, a—g).

У всех исследуемых штаммов дрожжей, по сравнению с контрольными данными, наблюдается задержка роста — период лаг фазы увеличивается до 12 ч, а для штамма Cryptococcus sp. WT до 24 ч, происходит уменьшение периода экспоненциальной фазы роста и увеличение периода фазы замедленного роста. Максимальное накопление биомассы в среде культивирования со свинцом наблюдается через 24 ч культивирования и составляет 1,75 г/л АСВ для штаммов R. mucilaginosa УКМ-1776, S. cerevisiae УКМ-1968, C. krusei УКМ-61t; для штаммов R. aurantiaca УКМ-1195, Rhodotorula sp. 4, W. californica УКМ-248 — 48 ч культивирования и составляет 2,5 г/л АСВ; для штамма Cryptococcus sp. WT максимальное накопление биомассы в среде отмечается через 72 ч культивирования — до 3 г/л АСВ.

В присутствии фосфатов растворимость свинца такова, что в виде ионов он находится только при низких значениях рН [2, 7]. Исследуемые штаммы являются кислотоустойчивыми, так как наблюдается снижение рН среды до 2, такое же подкисление среды происходит и в контроле у всех исследуемых штаммов. При этом заметна строгая корреляция снижения рН среды с увеличением концентрации клеток дрожжей в растворе, а также уменьшение количества биомассы при наличии в среде данного иона.

Полученные данные свидетельствуют о том, что более устойчивыми являются пигментированные штаммы R. mucilaginosa УКМ-1776 и Cryptococcus sp. WT, они легче адаптируются к высоким концентрациям свинца в растворе. Таким образом, данные штаммы могут быть рекомендованы для дальнейших исследований как штаммы-сорбенты ионов свинца для очистки сточных вод, загрязнённых тяжёлыми металлами.

Литература
1. Андреюк К.І., Іутинська Г.О., Антипчук А.Ф. та ін. Функціонування мікробних ценозів ґрунту в умовах антропогенного навантаження. —К.: Обереги, 2001. —240 с.
2. Работнова И.Л., Позмогова И.И. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. —Москва: Изд. "Наука", 1979. —209 с.
3. Cupta G., Keegan B. Bioaccumulation and biosorption of lead by poultry litter microorganisms // Poultry Sci. —1998. —77, №3. —P. 400—404.
4. Gadd G.M. Effect of copper on Aureobasidium pullulans in solid medium adaptation not necessary for tolerant behavior // Trans. Br. Mycol. Sci. —1984. —82, 3. —P. 546—549.
5. Jung Ho Suh, Dong Seog Kim, Jong Won Yun and Seung Koo Song Process of Pb²⁺ accumulation in Saccharomyces cerevisiae // Biotechnology Letters. —1998. —V. 2, №2. —P. 153—156.
6. Kasatkina T.et al. Saccharomyces cerevisiae yeast as a sorbent of heavy metals // 21st International Specialized symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of non-conventional yeasts": Proc. (Lviv, Ukraine, august 2001). —Lviv, 2001.
7. Marques P.A.S.S., Rosa M.F., Pinheriro H.M. pH effects on the removal of Cu²⁺, Cd²⁺ and Pb²⁺ from aqueous solution by waste brewery biomass // Bioprocess Engineering. —2000. —23. —P. 135—141.
8. McEldowney S., Hardman D.L., and Waite S. Pollution: ecology and biotreatment. —London: Longman Group UK Limited, 1993. —322 p.
9. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol. —1999. —51. —P. 730—750.
10. Volesky B., May-Phillips H.A. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae // Appl. Microbiol. Biotechnol. —1995. —42. —P. 797—806.

| Зміст |